Nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ duchenne

Phát hiên người mẹ mang gen dystrophin đột biến, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh sẽ giúp giảm tỷ lê bênh nhân DMD trong cộng đổng. Mục tiêu: xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bênh DMD. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: DNA được tách chiết từ tế bào ối của hai thai phụ mang gen dystrophin bị đột biến mất đoạn. Sử dụng phương pháp PCR và RFLP để phân tích gen dystrophin của thai nhi. Kết quả: giới tính của thai nhi được xác định gổm một nam và một nữ, hai thai nhi đều không mang gen đột biến. Kết luận: áp dụng thành công quy trình chẩn đoán trước sinh bênh DMD.
I.    ĐẶT VAN Để
Các bênh lý di truyền chiếm khoảng 20% các trường hợp tử vong trong giai đoạn sơ sinh cũng như chiếm một tỉ lê rất cao những bênh lý gặp phải trong thời kỳ nhũ nhi và trẻ nhỏ. Tần suất và mức độ nặng của các bênh lý di truyền đơn gen thay đổi tùy theo từng chủng tộc và có thể chiếm 2% tổng số trẻ sơ sinh [7]. Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD, Duchenne Muscular Dystrophy) là một trong những bênh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, với tần suất mắc bênh khá cao: 1/3500 trẻ trai. Bênh gây nên do đột biến gen dystrophin, gen này nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể X (NST). Gen có chức năng tổng hợp protein dystrophin. Protein này nằm ở màng tế bào cơ và có chức năng bảo vê màng tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bênh nhân bị thoái hóa dần. Bênh cảnh lâm sàng biểu hiên bằng yếu cơ nặng dần và cuối cùng tử vong do chưa có phương pháp điều trị đặc hiêu [6]. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bênh nhân DMD là do nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, chỉ 1/3 bênh nhân là do đột biến mới phát sinh. Do vậy, các tác giả quan tâm đến bênh DMD đều nhận định rằng, cho tới khi tìm được phương pháp điều trị có hiêu quả cho bênh DMD thì những nỗ lực nghiên cứu nhằm phát hiên người lành mang gen bênh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bênh nhân và chẩn đoán trước sinh trên những bà mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyền vẫn là biên pháp cơ bản phòng ngừa bênh DMD [5].
Mục tiêu nghiên cứu: áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD ở Việt Nam.
II.    ĐỐI TƯỢnG và PHƯƠNG pHÁp nghiên cứu
1.    Đối tượng nghiên cứu
–    Nhóm chứng: gổm 5 người nam và 5 người nữ bình thường, không có tiền sử gia đình mắc bênh di truyền.
–    Nhóm nghiên cứu: Hai gia đình của hai thai phụ có con trai mắc bênh DMD, hai thai phụ này đã được phân tích gen và phát hiên có kiểu gen dị hợp tử, mang gen dystrophin bị đột biến xóa đoạn giống con trai của họ.
2.    Phương pháp nghiên cứu
2.1.    Kỹ thuật tách chiết DNA tong số
Các mẫu DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của nhóm chứng, bênh nhân DMD, bố và mẹ bênh nhân. Máu được chống đông bằng EDTA với nổng độ 1,5mg/ml. Quy trình tách chiết DNA đã được chuẩn hóa và tiến hành theo phương pháp phenol/chloroform.
2.2.    Quy trình phản ứng xác định người mẹ dị hợp tử
Áp dụng phương pháp multiplex PCR định lượng của nhóm nghiên cứu Tạ Thành Văn tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1].
2.3.    Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD
2.3.1.    Chọc hút dịch ối: được tiến hành vào tuần thứ 14-18 của thai kỳ dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Thủ thuật được tiến hành tại Bênh viên Phụ Sản Trung Ương.
2.3.2.    Tách DNA của tê’bào ối: theo phương pháp phenol-chloroform.
2.3.3.    Xác định giới tính của thai nhi: sử dụng cặp mổi đặc hiêu khuếch đại đoạn gen SRY (có kích thước 254 bp) đặc hiêu trên NST Y. 
Mồi xuôi: 5’-CATGAACGCATTCATCGTGTGGTC-3’,
Mồi ngược: 5’-CTGCGGGAAGCAAACTGCAATTCT-3’.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: (1) giai đoạn biến tính ở 94°C trong 5 phút; (2) 35 chu kỳ gồm biến tính ở 94°C trong 45 giây, gắn mồi ở 52°C trong 60 giây và bước kéo dài 72°C trong 60 giây; (3) giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút. Bảo quản tạm thời sản phẩm PCRở 4°C.
Kết quả PCR được điện di trên agarose nồng độ 1,5%. Dựa vào sự xuất hiện vạch điện di có kích thước 254 bp, tương ứng với sự hiện diện của NST Y để xác định giới tính nam của thai nhi; ngược lại, không xuất hiện vạch điện di tương ứng chứng tỏ giới tính của thai nhi là nữ.
2.3.4.    Kỳ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism) phát hiện khả năng nhiễm DNA của mẹ vào mẫu DNA thai nhi
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen dystrophin có kích thước 216 bp. Sau đó, phân cắt đoạn gen trên bằng enzym giới hạn BamHI. Sản phẩm là: hoặc đoạn gen không bị cắt vẫn giữ nguyên kích thước 216 bp, hoặc bị cắt thành hai đoạn 166 bp + 50 bp. Điện di hỗn hợp sản phẩm trên agarose 2%. Phản ứng được tiến hành với mẫu DNA của mẹ, bố và DNA của thai nhi. Phân tích kết quả điện di, nếu không có sự nhiễm DNA của mẹ vào DNA thai nhi mới thực hiện phản ứng tiếp theo.
2.3.5.    Phản ứng PCRphân tích gen dystrophin của thai nhi
Trên cơ sở biết được vị trí các exon bị xóa đoạn ở bệnh nhân cũng như ở thai phụ (mẹ bệnh nhân), tiến hành phản ứng PCR khuếch đại các exon đó của DNA thai nhi. Mỗi phản ứng PCR có thể tích là 10 chứa các thành phần: 1 GeneAmp 10xBuffer, 20 ng mỗi primer, 100 ^mol/L dNTPs, 1 đơn vị enzym Taq polymerase (do hãng Takara, Nhật Bản cung cấp), và 30 ng DNA. Chu trình nhiệt tương tự như chu trình nhiệt của phản ứng xác đinh giới tính thai nhi.
Điện di kết quả trên agarose 1,5%, so sánh với mẫu đối chứng, nếu mẫu DNA của thai nhi xuất hiện vạch có kích thước bằng với mẫu đối chứng, trong khi mẫu bệnh nhân không xuất hiện vạch thì gen dystrophin của thai nhi không bị đột biến. Ngược lại, nếu mẫu DNA thai nhi không xuất hiện vạch như mẫu đối chứng là thai nhi bị đột biến xóa đoạn giống bệnh nhân (anh trai của thai nhi).