Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột ở người 2017-2020

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột ở người 2017-2020.Bệnh giun lươn (Strongyloidiasis) là bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột mạn tính ở người do giun Strongyloides spp. gây ra. Tỉ lệ lưu hành phần lớn chưa được xác định nhưng ước tính có khoảng 30 – 100 triệu người nhiễm [28], [39]. Khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam là vùng dịch tễ lưu hành của bệnh [99].
Người bị nhiễm giun lươn có thể biểu hiện từ không có triệu chứng đến triệu chứng không đặc hiệu của bệnh dạ dày tá tràng [16]. Vấn đề chẩn đoán chính xác ca bệnh gặp nhiều khó khăn và dễ bị bỏ sót [29], [85]. Nếu bệnh nhân không được phát hiện sớm, giun lươn có thể gây những tổn thương ở ruột rất khó hồi phục, cũng như ở nhiều cơ quan khác với các mức độ nặng khác nhau. Ngoài ra, những bệnh nhân cơ địa đặc biệt có nguy cơ mắc hội chứng tăng nhiễm giun lươn hay bệnh giun lươn lan tỏa với tỉ lệ tử vong cao [39], [84]. Vì vậy việc chẩn đoán nhiễm giun lươn là rất cần thiết.

Việc ứng dụng các phương pháp chẩn đoán giun lươn hiện nay vẫn tồn tại nhiều thách thức [29]. Soi phân tìm ấu trùng là phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm giun lươn thường được sử dụng nhiều nhất nhưng lại có độ nhạy rất thấp [31], [39]. Một phương pháp chẩn đoán khác cũng được sử dụng rộng rãi là tìm kháng thể giun lươn trong huyết thanh. Phương pháp này có độ nhạy cao nhưng có độ đặc hiệu thấp [39]. Phương pháp Baermann, cấy phân trên đĩa thạch hay nuôi cấy từ giấy lọc (Harada- Mori) giúp tăng khả năng phát hiện ấu trùng giun lươn trong phân nhưng có nhược điểm là: cần lượng phân nhiều, dụng cụ chuyên biệt, tốn nhân lực và thời gian, vì vậy không được sử dụng thường quy [16], [26], [39].2
Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán các tác nhân sinh học gây bệnh là một xu thế. Phương pháp PCR, real-time PCR có độ chính xác cao nhưng gặp nhiều khó khăn khi áp dụng tại thực địa do cần có quy trình kỹ thuật phức tạp, máy móc hiện đại và điều kiện nhiệt độ quyhuẩn, phù hợp với những trung tâm y học lớn. Các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt (trong đó thường dùng nhất là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian – Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP) không có các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn; kết quả xét nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường; thời gian xét nghiệm nhanh mà vẫn đạt được độ nhạy và đặc hiệu cao gần bằng với PCR. Vì vậy việc dùng LAMP với vai trò là một kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán tác nhân gây bệnh tại thực địa hay với mục tiêu tầm soát trên diện rộng là khả thi.
Hiện nay, tại Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột nào được thương mại hóa. Trong khi đó, Việt Nam có đủ điều kiện, cơ sở và nhu cầu thực tiễn để tiến hành nghiên cứu, phát triển ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột, giúp khắc phục được nhiều tồn tại của các phương pháp chẩn đoán khác và có thể áp dụng rộng rãi tại thực địa. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) ở người 2017-2020” với các
mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người.
2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa

Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) ở người 2017-2020
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………………….. 3
1.1 Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis ……. 3
1.2 Đặc điểm sinh học, bệnh học của giun lươn S. stercoralis………………… 4
1.2.1 Hình thái học…………………………………………………………………………………….4
1.2.2 Chu kỳ phát triển……………………………………………………………………………….6
1.2.3 Triệu chứng của bệnh giun lươn …………………………………………………………8
1.3 Chẩn đoán và điều trị bệnh giun lươn……………………………………………. 9
1.3.1 Định nghĩa ca bệnh do giun lươn Strongyloides stercoralis …………………..9
1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm giun lươn…………………. 10
1.3.3 Điều trị bệnh giun lươn…………………………………………………………………… 16
1.4 Tình hình nhiễm giun lươn………………………………………………………… 17
1.4.1 Tình hình nhiễm giun lươn trên thế giới …………………………………………… 17
1.4.2 Tình hình nhiễm giun lươn tại Việt Nam………………………………………….. 19
1.5 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP ……………………….. 20
1.5.1 Lịch sử phát triển LAMP………………………………………………………………… 20
1.5.2 Nguyên lý của kỹ thuật LAMP ……………………………………………………….. 21
1.5.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP……………………………………………….. 25
1.5.4 Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh ở người …. 25
1.6 Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán tác nhân
gây bệnh…………………………………………………………………………………………. 27
1.6.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP ………………………………………………….. 28
1.6.2 Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng LAMP …………………………………. 29vii
1.6.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật……….. 29
1.6.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit LAMP…………… 30
1.6.5 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit………………………………………………. 33
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….. 34
2.1 Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán
nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người……………….. 34
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………………….. 34
2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ……………………………………………………. 34
2.1.3 Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………………….. 34
2.1.4 Nội dung nghiên cứu………………………………………………………………………. 35
2.1.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ……………………………………………. 40
2.1.6 Các chỉ số đánh giá ………………………………………………………………………… 41
2.2 Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại
phòng thí nghiệm và thực địa …………………………………………………………….. 41
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………………….. 41
2.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ……………………………………………………. 42
2.2.3 Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………………….. 42
2.2.4 Nội dung nghiên cứu………………………………………………………………………. 45
2.2.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ……………………………………………. 48
2.2.6 Các chỉ số đánh giá ………………………………………………………………………… 49
2.2.7 Xử lý số liệu………………………………………………………………………………….. 49
2.3 Kiểm soát sai số ………………………………………………………………………. 51
2.4 Đạo đức trong nghiên cứu …………………………………………………………. 51
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………………. 53
3.1 Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun
lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người ……………………………….. 53
3.1.1 Kết quả thiết kế mồi……………………………………………………………………….. 53
3.1.2 Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 59
3.1.3 Ngưỡng phát hiện của bộ kit LAMP………………………………………………… 64viii
3.1.4 Kết quả xây dựng chứng dương………………………………………………………. 68
3.1.5 Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S. stercoralis……………. 70
3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí
nghiệm và thực địa …………………………………………………………………………… 73
3.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm.. 73
3.2.2 Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn
đường ruột…………………………………………………………………………………………………. 75
3.2.3 Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai
phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng…………………………………………. 80
3.2.4 Kiểm định tiêu chuẩn cơ sở bộ kit……………………………………………………. 86
Chương 4 BÀN LUẬN ……………………………………………………………………. 87
4.1 Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun
lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người ……………………………….. 87
4.1.1 Kết quả thiết kế mồi……………………………………………………………………….. 87
4.1.2 Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 90
4.1.3 Ngưỡng phát hiện của bộ kit …………………………………………………………… 95
4.1.4 Kết quả xây dựng chứng dương………………………………………………………. 96
4.1.5 Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S. stercoralis……………. 97
4.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí
nghiệm và thực địa …………………………………………………………………………… 97
4.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm.. 97
4.2.2 Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit…………………………………….. 98
4.2.3 Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai
phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng …………………………………………. 100
4.2.4 Đăng ký kiểm định tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit……………………………….. 109
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………….. 110
5.1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun
lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người ……………………………… 110

5.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí
nghiệm và thực địa …………………………………………………………………………. 111
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………. 112
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI
DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Yêu cầu khoảng cách giữa các mồi [108] ……………………………….. 36
Bảng 2.2 Yêu cầu nhiệt độ nóng chảy (Tm) của từng mồi………………………. 36
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LAMP ……………………………………………….. 37
Bảng 2.4: Các điều kiện cần tối ưu hóa ……………………………………………….. 37
Bảng 2.5 Bảng tính độ nhạy, độ đặc hiệu …………………………………………….. 50
Bảng 3.1 Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán giun lươn đường ruột .. 55
Bảng 3.2 Vị trí của các mồi được thiết kế…………………………………………….. 55
Bảng 3.3 Khoảng cách giữa các mồi được thiết kế ………………………………… 56
Bảng 3.4 Nhiệt độ nóng chảy và khả năng tạo bắt cặp dimer mồi (dG <-
2,34) của bộ mồi xác định giun lươn đường ruột …………………….. 56
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi…………………………….. 59
Bảng 3.6 Báo cáo quan sát chất chỉ thị màu MG ở các nồng độ khác nhau
trong thử nghiệm LAMP……………………………………………………… 63
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện sơ cấp của bộ mồi LAMP……. 65
Bảng 3.8 Khảo sát ngưỡng phát hiện của bộ kit chẩn đoán giun lươn
đường ruột………………………………………………………………………… 67
Bảng 3.9 Thành phần của bộ kít …………………………………………………………. 71
Bảng 3.10 Tóm lược kết quả xét nghiệm mẫu phân chẩn đoán GLĐR bằng
các phương pháp soi phân trực tiếp và real-time PCR………………. 73
Bảng 3.11 Tóm lược kết quả xét nghiệm mẫu phân chẩn đoán GLĐR bằng
các phương pháp soi phân trực tiếp và LAMP. ……………………….. 74
Bảng 3.12 Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán giun
lươn đường ruột…………………………………………………………………. 75
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit sau 6 tháng bảo quản ….. 76
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ ổn định sau 4 lần làm tan và đông đá……….. 77
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit sau 12 tháng bảo quản. .. 79
Bảng 3.16 Nội dung hoạt động tập huấn và đánh giá kit tại thực địa ………… 80xi
Bảng 3.17 Kết quả tầm soát giun lươn tại thực địa của 3 phương pháp……… 81
Bảng 3.18 Kết quả chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột tại thực địa của
qPCR và LAMP…………………………………………………………………. 81
Bảng 3.19 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa bộ kit LAMP trong nghiên
cứu và Bộ mồi Perdro…………………………………………………………. 82
Bảng 3.20 Tóm lược kết quả chẩn đoán nhiễm giun lươn tại khoa
Khám bệnh chuyên ngành bằng 3 phương pháp………………………. 84
Bảng 3.21 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa bộ kit LAMP trong nghiên
cứu và soi phân trực tiếp……………………………………………………… 84
Bảng 3.22 Kết quả đánh giá độ phù hợp giữa bộ kit LAMP trong nghiên
cứu và phương pháp ELISA ………………………………………………… 85
Bảng 3.23 Tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường
ruột Strongyloides stercoralis………………………………………………. 8