Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm

Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm.Rắn độc cắn là một bệnh lý nhiệt đới được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp vào nhóm bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên [1], [2]. Mỗi năm thế giới có tới 5 triệu người bị rắn cắn, làm chết khoảng từ 20.000 đến 125.000 người [3]. 50% số nạn nhân này thuộc về các quốc gia Châu Á và Châu Phi [4], [5]. Một trong những nguyên nhân quan trọng nhất làm cho số lượng bệnh nhân rắn cắn tử vong tăng là thiếu hoặc không có huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) để điều trị. Vấn đề này đang ở mức báo động toàn cầu [6], [7]. 

    Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới, rất thuận lợi cho các loài rắn độc phát triển, gây nạn cho người. Theo Nguyễn Văn Sáng và cs. (1996), trên phương diện sinh thái học, ở nước ta có khoảng 146 loài rắn, trong đó có 31 loài rắn độc nguy hại cho người (18 loài trên cạn và 13 loài rắn biển) [8]. Trong lĩnh vực y tế cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cắn, nghiên cứu của Trịnh Xuân Kiếm và cs. cho thấy có 2 họ rắn độc (họ rắn hổ và họ rắn lục) có tầm quan trọng y học, với 9 loài chủ yếu, bao gồm: rắn hổ đất, hổ mang, hổ mèo, hổ chúa, cạp nia Bắc, cạp nia Nam, cạp nong, lục xanh và choàm quạp. Các chuyên gia quốc tế ước tính tại Việt Nam mỗi năm có tới 30.000 người bị rắn độc cắn [9]. Về điều trị, HTKNR là thuốc đặc trị cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn [10], [11], [12]. Trước năm 1990, nước ta vẫn chưa sản xuất được bất cứ loại HTKNR để điều trị cho bệnh nhân nhiễm độc rắn độc. Hầu hết bệnh nhân rắn cắn phó thác sinh mạng vào kinh nghiệm chữa rắn độc của thầy lang hoặc đến các cơ sở y tế điều trị không đặc hiệu. Vì vậy, tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân rắn cắn nhiễm độc nặng khoảng 19.5% [13].  
    Đáp ứng yêu cầu thực tế này, từ năm 1990, Bộ Y tế đã cho phép Đơn vị nghiên cứu rắn, Bệnh viện Chợ Rẫy thực hiện loạt đề tài khoa học chế tạo HTKNR. Đến nay, có 07 loại HTKNR, bao gồm HTKNR hổ đất (Naja kaouthia), hổ mang (Naja atra), chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), hổ chúa (Ophiophagus hannah), cạp nia Nam (Bungarus candidus), cạp nia Bắc (Bungarus multicinctus) và lục xanh (Cryptelytrops albolabris) đã được sản xuất quy mô phòng thí nghiệm, ứng dụng lâm sàng an toàn và hiệu quả, góp phần quyết định giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% xuống còn khoảng 3,1% [9], [13]. 
    Tuy nhiên, bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo (RHM) (Naja siamensis) vẫn còn là vấn đề y tế tồn tại. Thực vậy, mỗi năm hàng trăm bệnh nhân bị RHM cắn nhập viện với tỷ lệ tử vong cao vì chưa có HTKNR đặc hiệu loài rắn này. Số bệnh nhân may mắn hồi phục cũng để lại thương tật suốt đời vì hậu quả hoại tử mô, bộ phận cơ thể do nọc RHM rất nặng nề [14], đòi hỏi cần sớm có huyết thanh kháng nọc RHM để điều trị đặc hiệu cho các bệnh nhân RHM cắn góp phần giảm tỷ lệ tử vong và tàn phế do loài rắn độc này gây ra. Từ đó đề tài “Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm” được tiến hành với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) đơn đặc hiệu dạng F(ab’)2 từ ngựa.
2. Đánh giá tính an toàn và hiệu lực của huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên thực nghiệm.

MỤC LỤC Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án 
Danh mục các bảng 
Danh mục các biểu đồ 
Danh mục các sơ đồ 
Danh mục các ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ    1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU    3
1.1. RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN    3
1.1.1. Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn trên thế giới    3
1.1.2. Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn tại Việt Nam    3
1.2. NỌC RẮN VÀ NHIỄM ĐỘC NỌC RẮN    10
1.2.1. Nọc rắn    10
1.2.2. Nhiễm độc nọc rắn trên người    11
1.3. CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN    16
1.3.1. Cấp cứu đầu tiên    16
1.3.2. Điều trị không đặc hiệu    18
1.3.3. Điều trị đặc hiệu    20
1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN    21
1.4.1. Khái niệm và phân loại huyết thanh kháng nọc rắn    21
1.4.2. Qui trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn    24
1.4.3. Các thử nghiệm đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn    27
1.4.4. Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn ở Việt Nam    30
1.5. RẮN HỔ MÈO    31
1.5.1. Đặc điểm nhận dạng và phân bố    31
1.5.2. Nọc rắn hổ mèo    31
1.5.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ mèo    32
1.5.4. Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo    35
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    38
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU    38
2.1.1. Động vật nghiên cứu    38
2.1.2. Hóa chất sinh phẩm    39
2.1.3. Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu    40
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    40
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu    40
2.2.2. Nội dung nghiên cứu    42
2.2.3. Các phương pháp kỹ thuật tiến hành    42
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU    63

2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU    64

2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU    64

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    65
3.1. CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO    65
3.1.1. Kết quả chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo    65
3.1.2. Kết quả gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo    72
3.1.3. Kết quả phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa sau mỗi lần gây miễn dịch    75
3.1.4. Kết quả lấy máu, tách huyết tương và truyền trả khối hồng cầu    77
3.1.5. Kết quả tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 từ ngựa    77
3.1.6. Kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu tại Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế    82
3.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT    83
3.2.1. Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo    83
3.2.2. Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (median effective dose-ED50)    85
3.2.3. Thử nghiệm đánh giá chất gây sốt (Pyrogen test) huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    88
3.2.4. Thử nghiệm đánh giá tính an toàn (Safety test) huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    89
3.2.5. Thử nghiệm đánh giá tính vô khuẩn (Sterility test) huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    94
3.2.6. Thử nghiệm xác định hàm lượng Thimerosal, pH và natri clorid trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    94
3.2.7. Đánh giá tính đặc hiệu của huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    95
3.2.8. Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2    98
Chương 4. BÀN LUẬN    99
4.1. DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO    99

4.1.1. Dịch tễ rắn hổ mèo và cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc    99
4.1.2. Thu nhận nọc rắn hổ mèo    100
4.2. QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ QUI TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH    101
4.2.1. Chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo    101
4.2.2. Lựa chọn động vật gây miễn dịch    102
4.2.3. Lựa chọn tá chất phù hợp và kích thích tạo kháng thể    103
4.2.4. Lịch trình gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên giải độc tố    105
4.2.5. Lấy máu thu hoạch huyết tương và truyền trả khối hồng cầu    107
4.3. QUI TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2    109
4.3.1. Lựa chọn huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn giá trên thực nghiệm    109
4.3.2. Lựa chọn qui trình tinh chế huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn giá dạng F(ab’)2    110
4.3.3. Qui trình sản xuất công nghiệp    112
4.4. CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN    113
4.4.1. Lựa chọn huyết thanh kháng nọc rắn dạng F(ab’)2    113
4.4.2. Lựa chọn dạng thành phẩm của huyết thanh kháng nọc rắn dạng F(ab’)2    113
4.5. ĐÁNH GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM    114
4.5.1. Đánh giá hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn    114
4.5.2. Đánh giá tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn    115
4.5.3. Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn    116
4.5.4. Đánh giá tính đặc hiệu của huyết thanh kháng nọc rắn    116
4.6. NHỮNG ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN    117
KẾT LUẬN    118
KIẾN NGHỊ    119
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN    120
TÀI LIỆU THAM KHẢO    121
PHỤ LỤC    134

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng    Tên bảng    Trang
1.1.     Đặc điểm lâm sàng phân biệt về 6 loại rắn độc cắn thường gặp    35
2.1.     Liều lượng kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo và các loại tá chất Freund dùng cho gây miễn dịch.    46
2.2.     Tiêu chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn cần đạt.    54
3.1.     Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn hổ mèo    65
3.2.     Kết quả chuẩn bị kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo theo lịch trình gây miễn dịch cho ngựa    67
3.3.     Kết quả cấy vi trùng, vi khuẩn kỵ khí và vi nấm với kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo    69
3.4.     Liều lượng kháng nguyên và số mũi tiêm thực tế trong quá trình gây miễn dịch    72
3.5.     Bảng theo dõi sức khoẻ ngựa trong quá trình gây miễn dịch    74
3.6.     Kết quả hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo sau gây miễn dịch bằng kỹ thuật ELISA    76
3.7.     Bảng kết quả lấy máu ngựa tách huyết tương và truyền trả 
hồng cầu    77
3.8.      Kết quả kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    83
3.9.     Xác định liều gây chết trung bình (LD50) nọc rắn hổ mèo    84
3.10.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    86
3.11.     Bảng kết quả thử nghiệm thăm dò    88
3.12.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định chất gây sốt huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    88
3.13.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên chuột lang (Lô thí nghiệm)    89
3.14.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên chuột lang (Lô chứng)    90
3.15.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên chuột nhắt trắng (Lô thí nghiệm)    91
3.16.     Bảng kết quả thử nghiệm xác định tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên chuột nhắt trắng (Lô chứng)    92
3.17.     Kết quả cấy vô khuẩn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    94
3.18.     Kết quả pH, hàm lượng Thimerosal và Natri clorid trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    94
3.19.     Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo    98
4.1.     So sánh đặc tính huyết thanh kháng nọc rắn dạng IgG, F(ab’)2 và Fab     111

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ    Tên biểu đồ    Trang
1.1.     Phân bố các loại rắn độc cắn ở Bệnh viện Chợ Rẫy từ năm 
1990-1998.    9
1.2.     Số lượng bệnh nhân rắn cắn và tử vong tại Trung tâm cấp cứu 
Sài Gòn và Bệnh viện Chợ Rẫy từ năm 1979-1996.    9
3.1.     Hiệu giá kháng thể sau gây miễn dịch lần 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 của ngựa số 1 sau tiêm kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo.    76
3.2.     Kết quả định lượng protein trong huyết thanh kháng nọc rắn 
hổ mèo    95
3.3.     Kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo bằng phương pháp ELISA    97

 
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ    Tên sơ đồ    Trang
2.1.     Sơ đồ nghiên cứu.    41
2.2.     Các bước thu thập nọc rắn, xử lý chế tạo kháng nguyên     44
2.3.      Sơ đồ vị trí gây miễn dịch trên ngựa.    45
2.4.    Lịch trình gây miễn dịch, lấy máu xét nghiệm kiểm tra hiệu giá kháng thể và lấy máu thu hoạch huyết tương ngựa.    46
2.5.      Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa trước và sau gây miễn dịch theo lịch trình qui định đối với kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo (NS antigen) và nọc rắn hổ mèo thô (NS venom).    48
2.6.     Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony tìm hiệu giá kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa chưa gây miễn dịch và đã gây miễn dịch tháng thứ 3.    49
2.7.     Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định phản ứng chéo huyết tương ngựa chưa gây miễn dịch và huyết tương ngựa đã gây miễn dịch tháng thứ 3 bằng giải độc tố nọc rắn hổ mèo với nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia-NK) và nọc rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma-CR).    49
2.8.     Sơ đồ tinh chế và đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo.    53

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1.    Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, Hoàng Anh Tuấn (2015). Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam. Tạp chí Y Dược học quân sự, 40(2):43-49. 
2.    Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, Hoàng Anh Tuấn, Thái Danh Tuyên (2015). Nghiên cứu chế tạo thành công huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) tại Việt Nam. Tạp chí Y học Việt Nam, 436(2):24 -28.