Nghiên cứu chế tạo IgG kháng vi rút Colti nhóm B họ Reoviridae cho bộ sinh phẩm ELISA Sandwich

Trong những thập kỷ gần đây, nhân loại phải đối mặt với nhiều dịch bênh mới do vi rút gây ra như đại dịch HIV, dịch SARS, dịch cúm A H5N19 H^N^.-.hậu quả làm tổn thất nặng nề tới sức khỏe và kinh tế của nhiều quốc gia. Đối với khu vực châu Á sự mới phát hiên vi rút Chandipura thuộc họ Rhabdoviridae ở Ấn Độ trong thập kỷ 70, vi rút Banna (vi rút Colti nhóm B) một thành viên thuộc họ Reoviridae ở Trung Quốc thập kỷ 90, vi rút Nipah thuộc họ Paramyxoviridae ở Malaysia vào những năm cuối của thế kỷ XX, vi rút Nam Định là vi rút Nido (Nidovirus) thuộc họ Nidoviridae ở Việt Nam năm 2002, [13], [34], [87], [88], [89] cũng là một điều đáng lo ngại cho cộng đổng về diễn biến của dịch bệnh trong tương lai.

Năm 2005, Việt Nam phân lập được một chủng vi rút mới từ dịch não tuỷ bệnh nhân HCNC, ở tỉnh Gia Lai, Tây Nguyên trên tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36. Chủng vi rút này được ký hiệu là 05VN255 và được xác định là vi rút Colti nhóm B, cùng nhóm gien với vi rút Banna phân lập ở Trung Quốc từ năm 1987, đây là chủng vi rút thuộc họ Reoviridae đầu tiên được phân lập từ bệnh nhân HCNC ở Việt Nam [3], [19]. Cho đến nay, ngoài vi rút VNNB gây HCNC, một số vi rút khác như vi rút đường ruột, vi rút Herpes, Cytomegalo vi rút… đã được xác định là nguyên nhân gây HCNC ở Việt Nam. Tuy vậy chỉ có khoảng 20 – 50% nguyên nhân vi rút gây HCNC được xác định, còn khoảng 50 – 80 % HCNC nghi ngờ do vi rút chưa được xác định nguyên nhân. Điều này cho thấy sự cần thiết phát triển sinh phẩm chẩn đoán, đặc biệt đối với những vi rút mới phát hiện như vi rút Colti nhóm B để góp phần xác định căn nguyên gây HCNC do vi rút ở Việt Nam. Nhưng cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán thường tập trung vào các vi rút đã biết và gây bệnh mang tính toàn cầu như: HIV,

HBV, HCV… Việc nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán những vi rút mới xuất hiện, mang tính chất khu vực còn hạn chế do nhiều nguyên nhân, đặc biệt là yếu tố thương mại. Ví dụ như đối với vi rút viêm não Nhật Bản, là nguyên nhân hàng đầu gây viêm não cho trẻ em trong khu vực châu Á, được phát hiện từ năm 1935, nhưng cho đến nay vẫn chưa có sinh phẩm thương mại quốc tế để chẩn đoán [59], [95]. Do vậy, Tổ chức Y tế thế giới đề nghị các nước tự sản xuất sinh phẩm chẩn đoán vi rút viêm não Nhật Bản cho kỹ thuật MAC-ELISA, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước. Vì vậy, đối với vi rút Colti nhóm B (vi rút Banna) cũng không phải là ngoại lệ, vi rút này đã được phát hiện từ bệnh nhân ở Trung Quốc trên 20 năm, nhưng hiện vẫn chưa có sinh phẩm chẩn đoán được thương mại [16], [18], [20], [52]. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, cần có sinh phẩm để thực hiện những nghiên cứu phát hiện, giám sát sự lưu hành của vi rút Colti nhóm B tại Việt Nam, trên cơ sở đó định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về vai trò gây bệnh của vi rút để đề xuất các biện pháp phòng bệnh có hiệu quả. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế tạo IgG kháng vi rút Colti nhóm B họ Reoviridae cho bộ sinh phẩm ELISA Sandwich” với mục tiêu:

1. Chế tạo IgG thỏ kháng vi rút Colti nhóm B chủng 05VN255 cho bộ sinh phẩm ELISA Sandwich chẩn đoán vi rút Colti nhóm B (vi rút Banna).

2. Đánh giá sự ổn định, hiệu quả phát hiện vi rút Colti nhóm B (vi rút Banna) của bộ sinh phẩm ELISA Sandwich.

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục

Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đổ Danh mục ảnh Danh mục hình

Đặt vân đề Error! Bookmark not defined.

Chương 1: Tổng quan Error! Bookmark not defined.

1.1. Vi rút Colti Error! Bookmark not defined.

1.1.1. Lịch sử phát hiên vi rút Colti Error! Bookmark not defined.

1.1.2. Phân loại vi rút Colti Error! Bookmark not defined.

1.1.3. Đặc điểm sinh học của vi rút Colti Error! Bookmark not defined.

1.1.4. Khả năng gây bênh Error! Bookmark not defined.

1.1.5. Dịch tễ học Error! Bookmark not defined.

1.2. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán vi rút Colti nhóm B. Error!

Bookmark not defined.

1.2.1. Phương pháp hiển vi điên tử Error! Bookmark not defined.

1.2.2. Phương pháp phân lập vi rút. Error! Bookmark not defined.

1.2.3. Phương pháp huyết thanh miễn dịch học Error! Bookmark not defined.

1.2.4. Phương pháp sinh học phân tử Error! Bookmark not defined.

1.3. Các phương pháp sản xuất và tinh chế kháng thể …Error! Bookmark

not defined.

1.3.1. Các phương pháp sản xuất kháng thể Error! Bookmark not defined.

1.3.2. Các phương pháp cô đặc và tinh chế kháng thể Error! Bookmark not defined.

1.3.3. Kiểm tra đô tinh sạch của IgG Error! Bookmark not defined.

1.3.4. Xác định hàm lượng protein kháng thể Error! Bookmark not defined.

1.3.5. Sự cần thiết và nguyên tắc chế tạo bô sinh phẩm ELISA Error! Bookmark not defined.

1.3.6. Nguyên tắc đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán Error! Bookmark not defined.

Chương 2: Đối Tượng, vật liêu và phương pháp nghiên cứu .Error! Bookmark not

defined.

2.1. Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.2. Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.2.1. Đông vật nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.2.2. Sinh phẩm Error! Bookmark not defined.

2.2.3. Dung dịch đêm chuẩn và hoá chất Error! Bookmark not defined.

2.2.4. Các dụng cụ Error! Bookmark not defined.

2.3. Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.3.1. Thiết kế và sơ đổ nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.3.2. Các kỹ thuật chế tạo kháng thể và công hợp, cho bô sinh phẩm ELISA Sandwich phát hiên vi rút Colti nhóm B Error! Bookmark not defined.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

3.1. Kết quả chế tạo IgG thỏ kháng vi rút Colti nhóm B và cộng hợp… Error! Bookmark not defined.

3.1.1. Kết quả chế tạo IgG thỏ kháng vi rút Error! Bookmark not defined.

3.1.2. Kết quả chế tạo IgG thỏ kháng vi rút Colti nhóm B chủng 05VN255 gắn enzyme HRPO. Error! Bookmark not defined.

3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá của IgG thỏ kháng vi rút Colti nhóm B và công hợp gắn enzyme HRPO cho bô sinh phẩm ELISA Sandwich

Error! Bookmark not defined.

3.1.4. Kết quả xác định đô nhạy và đô đặc hiệu của bô sinh phẩm chế tạo cho kỹ thuật ELISA- Sandwich phát hiện vi rút Colti nhóm B Error! Bookmark not defined.

3.1.5. Thiết kế bô sinh phẩm ELISA Sandwich dùng để phát hiên vi rút hoặc kháng nguyên vi rút Colti nhóm B Error! Bookmark not defined.

3.2. Kết quả đánh giá đô ổn định và hiệu quả chẩn đoán vi rút Colti

nhóm B của Bô sinh phẩm mới chế’ tạo 76

3.2.1. Kiểm tra sự ổn định của bô sinh phẩm ELISA Sandwich. Error! Bookmark not defined.

3.2.2. úng dụng bô sinh phẩm ELISA Sandwich để phát hiên vi rút Colti nhóm B. Error! Bookmark not defined.

Chương 4: Bàn luận Error! Bookmark not defined.

4.1. Việc chế’ tạo IgG kháng vi rút Colti nhóm B chủng 05VN255 và

công hợp Error! Bookmark not defined.

4.1.1. Chế tạo IgG thỏ đặc hiệu kháng vi rút Error! Bookmark not defined.

4.1.2. Việc chế tạo IgG kháng vi rút Colti nhóm B gắn enzyme HRPO Error! Bookmark not defined.

4.2. Đô ổn định và hiệu quả chẩn đoán vi rút Colti nhóm B của sinh

phẩm chế’ tạo so sánh với phương pháp khác….Error! Bookmark not defined.

4.2.1. Sự ổn định của bô sinh phẩm ELISA Sandwich Error! Bookmark not defined.

4.2.2. Phát hiện vi rút Coltinhóm B bằng bô sinh phẩm ELISA Sandwich Error! Bookmark not defined.

4.2.3. Ưu điểm của việc sử dụng bô sinh phẩm ELISA cho xét nghiệm Error! Bookmark not defined.

4.2.4. Những định hướng cho nghiên cứu tiếp theo Error! Bookmark not defined.

Kết luận Error! Bookmark not defined.

Kiến nghị Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐEN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC