Nghiên cứu chế tạo IGG thỏ kháng virut Nam Định gắn Enzym Horseradish Peroxidase

Cho đến nay vẫn còn rất nhiều bệnh cấp tính hoặc mãn tính ở người không rõ căn nguyên và virut được cho là nguồn gốc của nhiều bệnh, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu thường tập trung vào những virut đã được biết, ngược lại những khám phá về một virut chưa biết và chế tạo sinh phẩm chẩn đoán còn là những sự kiện ít được ghi nhận [1].
Năm 2002, có một chủng virut mới được phân lập từ dịch não tuỷ bệnh nhân hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam, chủng virut mới có khoảng 45% trình tự vật liệu di truyền tương tự virut arteri và được đặt tên theo nơi cư trú của bệnh nhân: Chủng virut Nam Định (NĐi). Virut NĐi là một virut thuộc họ arteri lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam. Cho đến nay đã phân lập được 14 chủng virut NĐi từ dịch não tuỷ của bệnh nhân, từ các mẫu muỗi ở một số tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [6]. Để xác định vai trò gây bệnh của virut NĐi bằng các kỹ thuật chẩn đoán và giám sát huyết thanh học cần có sinh phẩm. Do vậy nghiên cứu chế tạo sinh phẩm cho chẩn đoán và giám sát sự lưu hành của virut NĐi là một vấn đề cấp thiết. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm mục tiêu:
1.    Tinh chế IgG thỏ kháng virut Nam Định từ huyết thanh thỏ toàn phần.
2.    Chế tạo cộng hợp IgG thỏ kháng  virut Nam Định gắn enzyme horseradish peroxidase (HRPO).
II.    VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    Vật liệu
Mẫu huyết thanh: Huyết thanh thỏ toàn phần kháng virut NĐi: 30ml.
Dung dịch: 10mM sodium carbonate, 0,2M sodium carbonate, 1mM sodium acetate, PBS (-) và  các  dung  dịch  cần  thiết  khác  cho  kỹ  thuật ELISA.
Hoá chất: HRPO, NaIO4, NaBH4, BSA, cơ chất ortho phenylene diamine và các hoá chất cần thiết khác.
Trang thiết bị và dụng cụ: Bộ kit tách chiết IgG từ huyết thanh toàn phần (MAb-Trap kit) của Am- ersham Biociences AB, Thuỵ Điển, hộp thẩm tích (dialysis cassettes) của Perbio, bơm nhu động, giá đỡ cột tách chiết, máy quay điện từ, máy quang phổ, máy đọc  ELISA và các dụng cụ  cần thiết khác.
2.    Phương pháp
Tinh chế IgG từ huyết thanh thỏ toàn phần: Huyết thanh thỏ toàn phần được bất hoạt 560C/30 phút. IgG kháng virut NĐi được tinh chế từ huyết thanh thỏ toàn phần bằng bộ kit tách chiết MAb Trap. Quá trình tinh chế IgG từ hưyết thanh thỏ toàn phần thực hiện theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm. Hàm lượng protein (mg/ml) của IgG thỏ kháng virut NĐi được đo bằng máy quang phổ, tính theo công thức: giá trị OD280  x 1,45 – giá trị của OD260  x 0,75.
Gắn HRPO với IgG thỏ kháng virut NĐi theo TCNCYH 42 (3) – 2006 phương pháp của Wilson và Nakane [7]. Kiểm tra IgG thỏ kháng virut NĐi và cộng hợp theo nguyên lý kỹ thuật ELISA Sandwich [4]. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA với bước sóng 492nm/620nm. Hiệu giá kháng nguyên virut được xác định gián tiếp bằng giá trị mật độ quang học với điều kiện OD của chứng âm, OD của chứng blank ≤ 0,200, tỷ số của OD mẫu chứng dương/OD chứng âm ≥ 3 [4].
Virut Nam Định một virut thuộc họ arteri mới được phát hiện ở Việt Nam năm 2002, nên chưa có sinh phẩm cho các kỹ thuật ELISA để chẩn đoán. Mục tiêu: (1) Tinh chế IgG thỏ kháng virut Nam Định từ huyết thanh thỏ toàn phần. (2) Chế tạo cộng hợp IgG thỏ kháng virut Nam Định gắn enzym HRPO. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 30 ml huyết thanh thỏ toàn phần kháng virut Nam Định được sử dụng để tinh chế IgG thỏ bằng bộ kit MAb Trap, sử dụng IgG thỏ tinh chế để gắn enzym HRPO. Kết quả và kết luận: Tinh chế được 3 ml IgG thỏ kháng virut NĐi, hàm lượng protein ≅ 10mg/ml. Tạo được 2ml cộng hợp từ 1ml IgG thỏ kháng virut Nam Định, cộng hợp IgG thỏ kháng virut Nam Định rất tinh khiết với giá trị OD mẫu chứng âm và blank rất thấp < 0,050 (tiêu chuẩn cho phép ≤ 0,200), rất đặc hiệu với virut Nam Định.