Nghiên cứu cơ cấu ký sinh trùng sốt rét và Plasmodium falciparum kháng thuốc bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction tại vùng sốt rét lưu hành nặng

Sốt rét là bênh phổ biến và nghiêm trọng trên thế giới, hàng năm có khoảng hơn 3200 triệu người (40% dân số) có nguy cơ nhiễm sốt rét. Ước tính hàng năm có 350-500 triệu người mắc và hơn 1 triệu người chết do sốt rét, trong đó đa số là trẻ em dưới 5 tuổi ở Châu Phi và Nam Sahara [70].

Việt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng của thế giới, là một trong những nước có nguy cơ cao về bệnh sốt rét, vùng sốt rét lưu hành còn rộng, trên 27,4 triệu dân sống trong vùng sốt rét (trên 32% dân số toàn quốc). Để phòng chống sốt rét có hiệu quả, một trong những biện pháp kỹ thuật mà Tổ chức Y tế thế giới đưa ra là cần phải giám sát chặt chẽ mầm bệnh sốt rét ở những khu vực còn bệnh sốt rét lưu hành, nghĩa là phải xác định cơ cấu ký sinh trùng sốt rét, khả năng nhạy, kháng của ký sinh trùng với các thuốc sốt rét đang sử dụng (WHO,1993).

Để chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét có nhiều phương pháp, như các phương pháp phát hiện hình thể, trong đó phương pháp xét nghiệm máu nhuộm Giêm sa là phương pháp kinh điển, đơn giản, rẻ tiền có thể thực hiện được ở mọi điều kiện, đảm bảo độ tin cậy. Song phương pháp này cũng có những nhược điểm là rất khó phát hiện những trường hợp có mật độ ký sinh trùng thấp trong máu hoặc những trường hợp nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng. Các phương pháp miễn dịch học (phát hiện kháng thể, hoặc kháng nguyên) cũng được áp dụng để nghiên cứu, chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét (phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phản ứng men ELISA, kỹ thuật parasight F). Nhược điểm của các phương pháp miễn dịch là nhiều khi không có mặt ký sinh trùng, nhưng phản ứng vẫn dương tính và có độ nhạy thấp [3], [26], [67], [108].

Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét dựa theo kiểu gen đặc hiệu của từng loài, nhờ phản ứng tổng hợp chuỗi Polymerase, vì vậy PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao.

Nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc có nhiều phương pháp in vivo, in vitro, tuy nhiên các kỹ thuật này cũng gặp nhiều hạn chế: in vitro khó áp dụng rông rãi trong vùng sốt rét lưu hành vì cần trang thiết bị phức tạp, và con người thành thạo về kỹ thuậtũThử nghiêm in vivo phụ thuộc vào sự hấp thu thuốc sốt rét của từng bênh nhân, test 28 ngày (theo dõi dài ngày) khó thực hiên ở thực địa, cũng đòi hỏi con người thành thạo kỹ thuật. Kỹ thuật PCR xác định kháng thuốc nhờ phát hiên các điểm đột biến trên gen có liên quan đến tính kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét cho độ chính xác cao.

Hiên nay ký sinh trùng sốt rét có hiên tượng nhạy trở lại vái SR2 (fansidar, S/P) là thuốc phối hợp sulfadoxin và pyrimethamin, một loại thuốc dễ sử dụng, rẻ tiền nếu được sử dụng lại rất có giá trị.

Việc nghiên cứu ứng dụng một kỹ thuật mái như PCR, để xác định ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc là cần thiết để giám sát được ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc, đặc biêt khi không thể thử nghiêm in vivo.

Để góp phần giám sát ký sinh trùng sốt rét ở vùng lưu hành bênh sốt rét thuộc Miền Trung và Tây Nguyên, đổng thời phát triển một kỹ thuật mái ở Viêt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài:

□Nghiên cứu cơ cấu ký sinh trùng sốt rét và Plasmodium falciparum kháng thuốc bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction tại vùng sốt rét lưu hành nặng“.

Mục tiêu của đề’ tài:

1. Xác định cơ cấu thành phần loài ký sinh trùng sốt rét tại một số điểm ở miền Trung và Tây Nguyên bằng kỹ thuật PCR, đối chiếu với kỹ thuật nhuộm Giêm sa.

2. Xác định tình trạng kháng thuốc sulfadoxin-pyrimethamin của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lưu hành nặng bằng kỹ thuật PCR.

MỤC LỤC

Trang bia phụ Trang

LỜl cảm ơn LỜl cam đoan

Mục lục l

Các chữ vlết tắt trong luân án lv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vll

Danh mục các blểu đổ vlll

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Tình hình nghlên cứu ký slnh trùng sốt rét 6

1.1.1. Nghlên cứu trên thế glớl 6

1.1.2. Nghlên cứu ở Vlêt Nam 14

1.2. Các kỹ thuât chẩn đoán ký slnh trùng sốt rét và ứng dụng 19

1.2.1. Các kỹ thuât chẩn đoán dựa vào hình thể ký slnh trùng sốt rét 19

1.2.2. Các kỹ thuât mlên dịch học 22

1.2.3. Kỹ thuât phản ứng chuỗl polymerase 25

1.3. Các kỹ thuât nghlên cứu tính kháng thuốc 30

1.3.1. Kỹ thuât ln vlvo 30

1.3.2. Kỹ thuât ln vltro (WHO standard ln vltro technlque) 33

1.3.3. Kỹ thuât PCR 37

CHƯƠNG 2 : Đối TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1. Đốl tượng, địa đlểm, thỜl glan, vât llêu nghlên cứu 38

2.1.1. Đốl tượng nghlên cứu 3 8

2.1.2. Địa đlểm nghlên cứu 38 

2.1.3. Thòi glan nghlên cứu 39

2.1.4. Vât llêu nghlên cứu 39

2.2. Phương pháp nghlên cứu 41

2.2.1. Thlết kế nghlên cứu 41

2.2.2. Cỡ mẫu và kỹ thuât chọn mẫu 41

2.3. Các kỹ thuât sử dụng trong nghlên cứu 42

2.3.1. Kỹ thuât xét nghlêm máu nhuộm Glêm sa 42

2.3.2. Kỹ thuât thu mẫu máu bênh nhân sốt rét 43

2.3.3. Kỹ thuât tách ADN 43

2.3.4. Kỹ thuât PCR xác định loàl ký slnh trùng sốt rét 44

2.3.5. Kỹ thuât ln vlvo nghlên cứu P.falciparum kháng thuốc 45

2.3.6. Kỹ thuât PCR nghlên cứu P.falciparum kháng vớl pyrlmethamln 46

2.3.7. Kỹ thuât PCR nghlên cứu P.falciparum kháng vớl sulfadoxln 48

2.3.8. Kỹ thuât đlên dl agarose 51

2.3.9. Chỉ tlêu đánh glá kết quả 51

2.4. Lực lượng tham gla 54

2.5. Glớl hạn phạm vl nghlên cứu của luân án 55

2.6. Xử lý số llêu nghlên cứu 55

2.7. Vấn đề đạo đức trong nghlên cứu 55

CHƯƠNG 3: KÊT QUẢ NGHIÊN cứu 56

3.1. Cơ cấu thành phẩn loàl ký slnh trùng sốt rét tạl mlền Trung-Tây nguyên 56

3.1.1. Cơ cấu thành phẩn loàl ký slnh trùng sốt rét xác định bằng kỹ 56

thuât nhuộm Glêm sa

3.1.2. Cơ cấu thành phẩn loàl ký slnh trùng sốt rét xác định bằng kỹ 59

thuât PCR

3.1.3. Đốl chlếu cơ cấu thành phẩn loàl ký slnh trùng sốt rét bằng kỹ 73

thuât PCR và Glêm sa

3.2. Kết quả đánh giá P.falciparum kháng thuốc sốt rét tại vùng sốt rét lưu 76

hành nặng

3.2.1. Đối chiếu gen kháng thuốc và kết quả in vivo ở Quảng Trị 76

3.2.2. Xác định P.falciparum kháng pyrimethamin bằng kỹ thuật PCR 79

3.2.3. Xác định P.falciparum kháng sulfadoxin bằng kỹ thuật PCR 88

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 100

4.1. Nghiên cứu cơ cấu chủng loại ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR 100

4.2. Nghiên cứu P.falciparum kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR 112

4.2.1. Nghiên cứu P .falciparum kháng pyrimethamin 112

4.2.2. Nghiên cứu P.falciparum kháng Sulfadoxin 119

4.2.3. So sánh kỹ thuật in vivo và PCR trong nghiên cứu kháng SR2 125

4.3. Úng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu KSTSR 127

KẾT LUẬN 129

KIẾN NGHỊ 131

CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG Bố có LIÊN QUAN 132

ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133

PHỤ LỤC 159