Nghiên cứu đặc điểm di truyền một số chủng sởi đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp RFLP

Đề tài cấp Bộ :Nghiên cứu đặc điểm di truyền một số chủng sởi đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp RFLP.Bệnh sởi là một bệnh truyền nhiễm do virút gây nhiễm thuộc chi Morbillivirus, họ Paramyxoviridae. Quá trình lây nhiễm chủ yếu bằng đường hô hấp giải thích được tính chất dễ lây truyền của virút sởi. Bệnh sởi được miêu tả lần đầu tiên từ thế kỷ IX, cho đến nay bệnh vẫn phổ biến trên khắp thế giới với tỷ lệ mắc cao ở các nước đang phát triển. Bệnh lây truyền chủ yếu ở lứa tuổi trẻ em nhỏ, tuy nhiên trẻ em lớn và người trưởng thành vẫn có khả năng mắc bệnh. Sởi được coi như một bệnh nhẹ vì trong trường hợp bình thường, khoảng một tuần sau khi phát ban, bệnh nhân hồi phục hoàn toàn. Nhưng trong một số ít trường hợp, trẻ sơ sinh hoặc người lớn bị nhiễm sẽ để lại những di chứng nghiêm trọng do những biến chứng sau sởi. Những nguyên nhân chính do độc lực virút quá cao, đáp ứng miễn dịch không thích hợp hoặc trong nhiều trường hợp là do ở bệnh nhân có hiện tượng ức chế miễn dịch. Những trường hợp biến chứng nghiêm trọng thường xẩy ra ở các trẻ em dưới 5 tuổi hoặc ở người lớn trên 20 tuổi.

Trước khi có vắc xin, bênh sởi lây lan phổ biến ở trẻ em và 90% người có miễn dịch khi đến 15 tuổi. Năm 2001, theo công bố của Tổ chức Y tế Thế giới, 30-40 triệu người mắc bệnh sởi, trong đó 745.000 trường hợp tử vong. Những nước đang phát triển có tỷ lệ mắc cao nhất, chiếm 95% tỷ lệ tử vong của toàn cầu. Việt Nam được xếp vào danh sách những nước vẫn còn tỷ lệ mắc sởi, mặc dù tỷ lệ này đã giảm rõ rệt trong thập niên vừa qua.
Bệnh sởi không lây truyền qua vectơ trung gian. Con đường lây nhiễm chủ yếu là giữa cộng đồng dân cư, do vậy việc tiêm vắc xin đạt tỷ lệ cao là một biện pháp quyết định để khống chế bệnh sởi. Tiêm chủng vắc xin sởi ở nước ta bắt đầu được triển khai từ năm 1981. Đến 1989, trên 80 % trẻ em dưới một tuổi trên cả nước được tiêm chủng. Năm 2004-2005, tỷ lệ mắc đã giảm ở mức độ rất thấp với 0,16/100.000 dân.
Việc giảm tỷ lệ bệnh sởi là một thành công đáng kể của nước ta. Giai đoạn đặt ra tiếp theo là phải nỗ lực thực hiện việc khống chế bệnh sởi. Dịch tễ học đóng vai trò quan trọng trong việc giám sát những ca bệnh, nhằm xác định căn nguyên và tìm hiểu con đường lây bệnh. Dịch tễ học phân tử là phần không thể thiếu trong dịch tễ học. Đây là sự kết hợp chặt chẽ và hộ trợ lẫn nhau giữa thực địa và phòng thí nghiệm.
Đề tài “Nghiên cứu đặc điểm di truyền một số chủng sởi đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp RFLP (đa dạng độ dài đoạn cát giới hạn)” nhằm xây dựng một phương pháp mới cho phép gắn vào các chủng sởi một hình vạch ADN riêng biệt. Phương pháp này được áp dụng để phân tích genom của virút vắc xin và virút hoang dại.
Đê tài thực hiện nhằm hai mục tiêu chính:
–    Xây dựng phương pháp RFLP cho nghiên cứu dịch tễ phân tử bệnh
sởi.
–    Áp dụng phương pháp RFLP trên mô hình chủng vắc xin sỏi và một số chủng vi rút sỏi hoang dã phân lập từ bệnh nhân Việt Nam nhằm hoàn thiện phương pháp.
Đề tài nhằm đóng góp một phương pháp sinh học phân tử mới, hoàn toàn phù hợp với điều kiên nghiên cứu và phát triển dịch tễ học phân tử tại Việt Nam.
MỤC LỤC
Phần A- TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ Nổi BẬT CỦA ĐỂ TÀI    1
Phần B – NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIÊT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỂ TÀI CẤP BỘ    3
1.    ĐẶT VẤN ĐỂ    3
2.    TỔNG QUAN ĐỂ TÀI    10
2.1. DỊCH TỂ PHÂN TỬ    10
2.1.1    Dịch tễ phân tử – một công cụ chúih xác để xác địrìh các     
chủng gây bệnh    10
2.1.2.    Các phương phap phân tích thay đổi gen    11
2.1.2.1    Giải trình tự nucleotit     11
2.1.2.2    Phương pháp RFLP (Độ Đa dạng Độ dài Đoạn giói hạn)     11
2.2    VIRÚT SỞI     14
2.2.1.    Chẩn đoán phòng thí nghiệm     14
2.2.1.1.    Chẩn đoán huyết thanh học    14
2.2.1.1.    Phân lập và định loại virút trên nuôi cấy tế bào    16
2.2.2.    Dịch tễ phân tử bệnh sỏi    17
2.2.2.1.    Cấu trúc phân tử    17
2.2.2.2.    Danh pháp     18
2.2.2.3.    Phân bô’địa lý của các genotyp virút sởi    19
2.2.2.4.    Một số kết quả thế giới của dịch tễ học phân tử
áp dụng cho sởi    23
3.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu . 25
3.1    XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP RFLP PHÂN TÍCH GENOTYP
VIRÚT SỞI     25
3.2    CHỌN MẪU, Cơ MAU VÀ ĐốI TƯợNG NGHIÊN CứU    25
3.3    PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu    26
3.3.1.    Phân lập virút sởi trên nuôi cấy tê bào     26
3.3.2.    Tách chiết ARN    27
3.3.3.    Phản ứng RT-PCR và Nested PCR    28
3.3.4.    Phản ứng cắt giới hạn    29
3.3.5.    Điện di gel agarose    29
3.3.6.    Phương pháp nạp và xử lý các số liệu trình tự cácvirút sởi.. ..29
4.    KẾT QUẢ NGHIÊN cứu    30
4.1.    XÁC ĐỊNH ĐOẠN GENOM SỞI THAY Đổi NHlỂU NHẤT     30
4.2.    CHỌN CÁC ENZIM GIỚI HẠN     31
4.2.1.    Enzim giới hạn không tạo đa dạng    32
4.2.2.    Enzim giói hạn tạo ra độ đa dạng cao    33
4.3.    RT-PCR VÀ NESTED PCR    39
4.4.    CÁC HÌNH VẾT ADN CỦA GEN N CẮT GIỚI HẠN    40
4.4.1.    Chủng vắc xin    40
4.4.2.    Chủng hoang dại    42
5.    BÀN LUẬN    45
5.1.    DỊCH TẾ HỌC PHÂN TỬ TRONG CHIẾN Lược CHỐNG LẠI BẸNH TRUYỀN NHIÊM        45
5.1.1    Bệnh bại liệt    46
5.1.2    Bệnh lao    47
5.1.3    bệnh sởi     48
5.2    PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP DỊCH TỄ PHÂN TỬ
KHÔNG DÙNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH Tự    51
5.3.    KẾT QUẢ BAN ĐẦU VỂ CÁC HÌNH VẠCH CHỦNG SỞI
LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM        54
6.    KẾT LUẬN     57
KIẾN NGHỊ     58
TÀI LIỆU THAM KHẢO        59
PHU LUC     64