Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue (DENV) gây ra. Vi rút được truyền từ người sang người qua muỗi Aedes spp. Hiện nay, thế giới có hơn một phần ba dân số đang sống trong các  bệnh và tử vong ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới [1], [2]. Sốt xuất huyết Dengue đã trở thành một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng. Số ca nhiễm tăng lên 30 lần sau 50 năm và tỷ lệ tử vong chung khoảng 2,5% [3]. Theo ước tính, có 390 triệu người bị ảnh hưởng bởi nhiễm vi rút Dengue với hơn 25.000 ca tử vong/năm trên toàn cầu, trong đó 96 triệu (67–136 triệu) có biểu hiện lâm sàng. Khu vực Đông Nam Á trải qua dịch bệnh tái phát và mang tính chu kỳ sốt xuất huyết quanh năm. Vị trí địa lý, thời gian cũng chỉ ra mức độ phổ biến của bệnh [4]. Theo WHO, 10 trong số 11 quốc gia thành viên của Đông Nam Á là nơi lưu hành dịch SXHD. Đặc biệt, Ấn Độ, Indonesia, Myanmar, Sri Lanka và Thái Lan nằm trong số 30 quốc gia có mức độ lưu hành cao nhất trên thế giới [5].

Tại Việt Nam, trước năm 2020, tình hình dịch SXHD diễn biến phức tạp theo chu kỳ 4 – 5 năm. Năm 2016, cả nước có 109.399 trường hợp mắc SXHD tại 56 tỉnh thành phố, trong đó có 36 ca tử vong. Năm 2019, có 335.056 ca, trong đó có 55 ca tử vong [6]. Thống kê của Bộ Y tế cho thấy SXHD đứng thứ ba trong số các bệnh truyền nhiễm gây dịch của năm 2020, với 137.470 trường hợp mắc, 29 trường hợp tử vong [7]. Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca SXHD và 140 ca tử vong [8]; tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca nhiễm, trong đó có 42 ca tử vong [9].
Bệnh SXHD được gây ra bởi bốn týp huyết thanh là: DENV1, DENV2, DENV3 và DENV4 của vi rút Dengue, có sự lưu hành khác nhau trong các khu vực mà bệnh SXHD phổ biến [10]. Bốn kiểu huyết thanh này có độ tương đồng2 trong trình tự bộ gen từ 60 – 80%, chúng gây ra các bệnh có biểu hiện giống cúm hoặc nghiêm trọng hơn như xuất huyết dẫn đến sốc có thể gây tử vong [11]. Bộ gen cấu trúc của vi rút Dengue mã hóa cho 3 protein cấu trúc (C, prM/M và E) và 7 protein phi cấu trúc (NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B và NS5) [12]. Protein NS1 là protein phi cấu trúc duy nhất được phát hiện trong máu  người bệnh SXHD trong giai đoạn cấp tính nhiễm trùng, thường là trước khixuất hiện các triệu chứng. Trong khi đó các protein khác chủ yếu ở nội bào hoặc liên kết với các hạt vi rút và thường không được giải phóng vào máu với số lượng có thể phát hiện được trong quá trình nhiễm trùng cấp tính. Một yếu tố nữa cũng khiến NS1 trở thành mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học do khả năng tạo miễn dịch cao có thể phát hiện bằng các kháng thể đặc hiệu với độ nhạy và độ đặc hiệu tốt nhất. Ngược lại, các protein khác được nhận định tạo ra các phản ứng miễn dịch kém hơn hoặc bị cô lập trong tế bào bị nhiễm bệnh hoặc các hạt vi rút khiến chúng khó được phát hiện trong máu [13].
Việc chân đoán phân biệt dựa trên các triệu chứng là một thách thức do các triệu chứng không đặc hiệu của bệnh sốt xuất huyết như sốt, đau nhức và mệt mỏi thường trùng lặp với các bệnh nhiễm trùng lưu hành khác. Tỷ lệ tử vong liên quan đến sốt xuất huyết có thể giảm từ 20–30% trong các trường hợp nặng xuống dưới 1% nhờ chân đoán sớm, sử dụng thuốc hợp lý và chăm sóc hỗ trợ thích hợp [14]. Các phương pháp truyền thống để chân đoán SXHD bao gồm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) để phát hiện RNA của vi rút Dengue hoặc phân lập vi rút, và sau đó sử dụng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA). Cả hai phương pháp này đều hiệu quả trong năm ngày đầu tiên khi bị nhiễm mầm bệnh, nhưng độ nhạy của các xét nghiệm này giảm theo thời gian khi lượng vi rút trong máu giảm dần [15], [16]. Hơn nữa, các phương pháp truyền thống này cần hệ thống phòng thí nghiệm chuyên sâu và kĩ thuật viên giàu kinh nghiệm để thực hiện nên khó triển khai rộng rãi ra cộng đồng. Trong số các protein tham gia cấu tạo hạt của vi rút Dengue và tham gia vào quá trình gây3 bệnh của của vi rút, protein NS1 là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng nhất trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm vi rút, do vậy protein này thường được sử dụng như chỉ thị phân tử protein trong chân đoán sốt xuất huyết do nhiễm vi rút Dengue. Một số xét nghiệm kháng nguyên NS1 khác cũng đã được báo cáo là có hiệu quả trong việc phát hiện vi rút Dengue trong quần thể. Điều này đồng nghĩa với việc sử dụng xét nghiệm kháng nguyên NS1 không chỉ cải thiện khả năng chân đoán mà còn đóng vai trò quan trọng trong quản lý nguồn bệnh và giám sát véc tơ [17]. Tuy nhiên, chưa có kháng nguyên NS1 gộp đủ cả 4 týp vi rút Dengue nào được sử dụng, điều này có thể bỏ sót một số trường hợp nhiễm vi rút Dengue. Việc có thêm một phương pháp chân đoán SXHD vừa đảm bảo độ nhạy, độ chính xác và tiện dụng là rất cần thiết, vì vậy đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022.
2. Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 1
Chương 1. TỔNG QUAN ……………………………………………………………………… 4
1.1. Tổng quan bệnh sốt xuất huyết Dengue………………………………………….. 4
1.1.1. Khái niệm……………………………………………………………………………. 4
1.1.2. Dịch tễ học ………………………………………………………………………….. 4
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue…………………………………. 6
1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng sốt xuất huyết Dengue…………………. 7
1.2.1. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp …………………………………….. 7
1.2.2. Biểu hiện cận lâm sàng ……………………………………………………….. 12
1.3. Chân đoán sốt xuất huyết Dengue ……………………………………………….. 15
1.3.1. Diễn biến lâm sàng sốt xuất huyết Dengue ……………………………. 15
1.3.2. Chân đoán mức độ bệnh………………………………………………………. 18
1.3.3. Chân đoán phân biệt …………………………………………………………… 20
1.4. Vi rút Dengue……………………………………………………………………………. 20
1.4.1. Vai trò gây bệnh…………………………………………………………………. 20
1.4.2. Cấu trúc vi rút Dengue………………………………………………………… 22
1.4.3. Cấu trúc của protein NS1 ……………………………………………………. 26
1.5. Sử dụng kháng nguyên trong chân đoán sốt xuất huyết Dengue………. 27
1.5.1. Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ………………………….. 27
1.5.2. Các kỹ thuật sử dụng kháng nguyên trong chân đoán………………. 29
1.6. Tình hình ứng dụng kháng nguyên NS1 trong chân đoán xác định kháng
thể IgM/IgG sốt xuất huyết Dengue và tiềm năng kết hợp NS1 và IgM
trong chân đoán nhanh ……………………………………………………………….. 32Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………… 36
2.1. Mục tiêu 1 ………………………………………………………………………………… 36
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………. 36
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……………………………………….. 36
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………….. 37
2.1.4. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………… 37
2.1.5. Các tiểu chuân và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu……………… 37
2.2. Mục tiêu 2. ……………………………………………………………………………….. 42
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………. 42
2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………… 42
2.2.3. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………. 43
2.3. Các biến số trong nghiên cứu………………………………………………………. 55
2.4. Sai số trong nghiên cứu………………………………………………………………. 59
2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu………………………………………… 59
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………………………………… 61
2.7. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………………. 63
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………………….. 63
3.1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết
Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175
năm 2022 …………………………………………………………………………………. 63
3.1.1.Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu …………………………….. 63
3.1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue64
3.1.3. Một số yếu tố liên quan với mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue81
3.2. Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả
phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA ………. 84
3.2.1. Thiết kế tạo kháng nguyên tái tổ hợp NS1 …………………………….. 84
3.2.2. Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi
rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuân E.coli ……………………………………. 893.2.3. Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của
kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA …… 95
Chương 4. BÀN LUẬN ………………………………………………………………………. 99
4.1. Đánh giá đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết
Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175
năm 2022. ………………………………………………………………………………… 99
4.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu……………………………………………. 99
4.1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue
……………………………………………………………………………………………………………..100
4.2. Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả
phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA …… 110
4.2.1. Về thiết kế kháng nguyên tái tổ hợp NS1…………………………….. 110
4.2.2. Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi
rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuân E.coli ………………………………….. 114
4.2.3. Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của
kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA …. 117
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 123
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………….. 125
TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI…………………………………………………………. 126
TÀI LIỆU THAM KHẢODANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Số lượng axit amin và trọng lượng phân tử của các protein cấu trúc
và phi cấu trúc của vi rút Dengue …………………………………………………………. 24
Bảng 2.1. Xây dựng đường chuân phát hiện màu braford………………………… 49
Bảng 2.2. Trình tự mồi khuếch đại các đoạn gen xác định týp huyết thanh của
vi rút Dengue……………………………………………………………………………………… 55
Bảng 2.3. Các biến số trong nghiên cứu ………………………………………………… 55
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi ………………………… 63
Bảng 3.2. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, nghề nghiệp………………. 64
Bảng 3.4. Số lượng triệu chứng cơ năng trên một người bệnh………………….. 66
Bảng 3.5. Tình trạng sốt ở đối tượng nghiên cứu trước khi vào viện…………. 66
Bảng 3.6. Đặc điểm sốt từ khi khởi phát bệnh theo giới tính ……………………. 67
Bảng 3.7. Đặc điểm sốt ở đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi ………………. 68
Bảng 3.8. Triệu chứng thực thể ở đối tượng nghiên cứu …………………………. 69
Bảng 3.9. Đặc điểm xuất huyết theo giới tính ……………………………………….. 69
Bảng 3.10. Đặc điểm dạng xuất huyết theo nhóm tuổi…………………………….. 70
Bảng 3.11. Số lượng dạng xuất huyết kết hợp………………………………………… 71
Bảng 3.12. Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo giới tính ………………………. 71
Bảng 3.13. Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo nhóm tuổi…………………….. 72
Bảng 3.14. Xét nghiệm công thức máu theo giới tính ……………………………… 72
Bảng 3.15. Xét nghiệm chỉ số đông máu theo giới tính …………………………… 74
Bảng 3.16. Xét nghiệm chỉ số đông máu theo nhóm tuổi…………………………. 75
Bảng 3.17. Xét nghiệm chức năng gan theo giới tính………………………………. 75
Bảng 3.18. Xét nghiệm chức năng gan theo nhóm tuổi……………………………. 76
Bảng 3.19. Xét nghiệm điện giải đồ của đối tượng nghiên cứu ………………… 77
Bảng 3.20. Xét nghiệm sinh hóa khác của đối tượng nghiên cứu ……………… 78Bảng 3.21. Mối liên quan giữa giới tính, tuổi, nghề nghiệp và mức độ bệnh sốt
xuất huyết Dengue………………………………………………………………………………. 81
Bảng 3.22. Mối liên quan giữa số ngày mắc bệnh trước khi vào viện và mức độ
bệnh sốt xuất huyết Dengue …………………………………………………………………. 81
Bảng 3.23. Mối liên quan giữa tiền sử bệnh và mức độ bệnh sốt xuất huyết
Dengue ……………………………………………………………………………………………… 82
Bảng 3.24. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số tiểu cầu ….. 82
Bảng 3.25. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hematocrit.83
Bảng 3.26. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hemoglobin.83
Bảng 3.27. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số hồng cầu … 83
Bảng 3.28. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số bạch cầu…..84
Bảng 3.29. Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể
kháng NS1 bằng rAgNS1-DENV1-4…………………………………………………….. 97DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn lâm sàng của SXHD ………………………………………… 18
Hình 1.2. Muỗi Ae. aegypti – Trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue……22
Hình 1.3. Cấu trúc của hạt vi rút Dengue ………………………………………………. 23
Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen và protein của vi rút Dengue ………………………….. 23
Hình 1.5. Cấu trúc 3D của dimer và hexamer NS1 DENV ………………………. 26
Hình 1.6. Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp…………………………….. 28
Hình 2.1. Kít Dengue Duo phát hiện NS1và IgG/IgM của vi rút Dengue ….. 40
Hình 2.2. Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET-rNS1 ở tế bào
E.coli DH5α……………………………………………………………………………………….. 45
Hình 2.3. Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET22b+ và rNS1 ở
tế bào E.coli BL21………………………………………………………………………………. 46
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng miễn dịch ELISA gián tiếp …………………………….. 51
Hình 3.1. Tiền sử bệnh của đối tượng nghiên cứu…………………………………… 64
Hình 3.2. Mức độ sốt xuất huyết Dengue ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện
Quân y 175 ………………………………………………………………………………………… 79
Hình 3.4. Vị trí của 4 đoạn trình tự trên protein NS1. ……………………………… 85
Hình 3.5. A: Cấu trúc mô phỏng của đoạn peptit 112-260 B ……………………. 86
Hình 3.6. Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 1G5.3 A: …….. 87
Hình 3.7. Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 2B. …………….. 88
Hình 3.8. Sàng lọc tế bào E.coli BL21 sau biến nạp ……………………………….. 89
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự Sanger cho khuân lạc số 2 ………………………. 90
Hình 3.10. Kiểm tra sự biểu hiện của NS1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện
nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau……………………………………………………. 91
Hình 3.11. Tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau. … 92
Hình 3.12. Tối ưu thời gian biểu hiện protein NS1 …………………………………. 92
Hình 3.13. Phương trình đường chuân Bradford …………………………………….. 94Hình 3.14. Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp NS1
gộp 4 và kháng thể NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng NS1 gộp 4 tự sản
xuất …………………………………………………………………………………………………… 94
Hình 3.15. Tối ưu hóa ELISA gián tiếp sử dụng protein tái tổ hợp NS1 mang
các điểm epitop nhận biết bốn týp huyết thanh DENV1-4……………………….. 95
Hình 3.16. Kết quả ELISA xác định mẫu dương tính sốt xuất huyết Dengue
trong 2 nhóm nghiên cứu. Giá trị cut-off = 0,353……………………………………. 96
Hình 3.17. Đường cong ROC đánh giá độ tin cậy của kháng nguyên tái tổ hợp
NS1 trong xét nghiệm ELISA………………………………………………………………. 9