Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpob, katg của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở việt nam

 

Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam.

[Luận án tiến sĩ y học] Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu gây tỷ lệ tử vong trên thế giới ngày nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1/3 dân số thế giới nhiễm lao. Mỗi năm, có thêm gần 9 triệu người mắc lao mới và khoảng 1,3 triệu người tử vong do lao. Trong đó, 81% số bệnh nhân thuộc về 22 nước có gánh nặng bệnh lao [133]. Trong khi đó , tỷ lệ phát hiện mặc dù liên tục được cải thiện nhưng chỉ đạt 66 % số bệnh nhân ước tính [133], do có những hạn chế về công tác chẩn đoán, đặc biệt là lao kháng thuốc. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được phát hiện và chữa trị đang tiếp tục lây lan cho cộng đồng.

Theo thống kê của WHO, Việt Nam là một quốc gia c ó tỷ lệ bệnh lao cao. Theo báo cáo của Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) năm 2013, tổng số người mắc lao là 190.000; trong đó, số người mắc lao mới khoảng 130.000, số trường hợp tử vong do lao ước tính là 17.000 người. Tình hình kh ng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đ ng lo ngại. Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở bệnh nhân điều trị lại là 23%, ở bệnh nhân lao mới là 4% [4].

Trong c ác loại kháng thuốc của vi khuẩn lao, kháng rifampicin và isoniazid – những thuốc chủ lực trong điều trị lao – được quan tâm nhất vì thường dẫn đến thất bại trong điều trị và tử vong. Theo định nghĩa của WHO, “lao kháng đa thuốc” là trường hợp kháng với ít nhất đồng thời rifampicin và isoniazid [135]. Sự đề kháng với 2 thuốc chống lao dòng 1 này được cho là c ó đột biến trên một số gen liên quan, đặc biệt là c ác gen rpoB và katG. Các nghiên cứu về t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao cho thấy, rất hiếm c c chủng kh ng rifampicin đơn thuần mà thường c t nhất 90 c c chủng lao lâm sàng kháng rifampicin đồng thời cũng kháng isoniazid [15], [62]. Như vậy, việc phát hiện c ác chủng lao kháng rifampicin cũng có nghĩa là xác định được lao kháng đa thuốc [92]. Các nghiên cứu về phân tử của vi khuẩn lao kháng
ifampicin đã công bố cho thấy, tính kháng rifampicin liên quan đến đột biến ở gen rpoB, còn kháng isoniazid thường liên quan đến đột biến ở gen katG [112], [140].

Chẩn đo án lao kháng thuốc chủ yếu vẫn dựa vào phương pháp kháng sinh đồ và phải mất khoảng 8 tuần mới cho kết quả. Chẩn đo án nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt là kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cần thiết trong công tác giám sát và kiểm soát lao. Các kit thương mại của nước ngoài chẩn đo án lao kháng thuốc c ó giá thành cao và thường chỉ nhằm vào c ác điểm đột biến 526, 531 trên gen rpoB và 315 trên gen katG. Các nghiên cứu về lao kháng thuốc ở từng khu vực lại phát hiện thêm c ác điểm đột biến ở vị trí khác như 514, 533, 176 trên gen rpoB; đặc biệt tần số các đột biến thay đổi giữa c ác cộng đồng người và vùng địa lý [15], [52], [65], [88], [110], [140]. Đ ặc điểm phân tử của c ác chủng kháng thuốc phân lập được từ c ác vùng khác nhau trên thế giới, nhất là từ c ác quốc gia c ó tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ lao kh ng thuốc cao s tạo điều kiện thuận lợi cho việc ph t triển c hiệu quả hơn c c phương ph p phân tử để ph t hiện nhanh ch ng t nh kh ng thuốc phù hợp với từng nước và từng khu vực. Việt Nam chưa c ó c ác dữ kiện đầy đủ về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc trong nước nên chưa c ó cơ sở để áp dụng nguyên bản kit chẩn đo án lao kháng thuốc của nước ngoài.

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam” nhằm mục tiêu:

1. Xác định đặc điểm phân tử gen rpoB và katG liên quan đến kháng đa thuốc của các chủng vi khuẩn lao phân lập được năm 2008-2009.

2. Xác định gá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi kh u ẩn lao kh áng đa th u ốc ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam

TIẾNG VIỆT

1. Đặng Đức Anh (2001), “Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số

thể bệnh lao”, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.

2. Bộ Y t ế (11/2010), Chiến lược phỏng chống lao quốc gia giai đoạn 2011-

2015.

3. Lê Huy Chính (2001), “Họ Mycobacteriaceae”, Vi sinh Y học, Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội, tr. 208-211.

4. Chương trình chống lao quốc gia (2015), Báo cáo tổng kết hoạt động

chống lao năm 2014 và phương hướng năm 2015.

5. Nguyễn Văn Duy (2010), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật DN A arrays trong việc phát hiện nhanh kháng sinh đồ của một số vi khuẩn gây bệnh, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, trường Đại học B ách khoa Hà Nội.

6. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), ” C ác phương pháp tách chiết nucleic

acid”, Sinh học phân tử (Khái ni ệm – phương pháp – ứng dụng), Nhà xuất bản Giáo dục, tr. 128-130.

7. Hoàng Hà (2009), Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng,

sinh học của vi khuẩn ở bệnh nhân lao phổi điều trị lại., Luận án Tiến sỹ y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội.

8. Nguyễn Thu Hà , Trần Văn Sáng, Đinh Ngọc Sỹ (2011), ” Lâm sàng, cận

lâm sàng và tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi tái phát”, JFran Viet Pneu, 02(03), tr. 64-68.

9. Lê Văn Phủng (2009), “Mycobacterium”, Atlas Hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc, Nhà xuất bản Y học, Hà nội, tr.69-72.

10. Trần Văn Sáng (2002), “Vi khuẩn lao”, Bệnh học lao, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 2002, tr. 29-44.
11. Nguyễn Thanh Sơn, Lương Thị Hồng Vân (2003), ”Đánh giá nghiệm pháp chan đo án ” , Phương pháp nghiên cứu khoa học ứng dụng trong Y-sinh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Ừ163-167.

12. Nguyễn Văn Việt (2011), “Mycobacterium tuberculosis”, Vi sinh y học, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr.228 – 235.

TIÉ NG ANH

13. Abate D., Taye B., Abseno M., et al. (2012), “Epidemiology of antituberculosis drug resistance patterns and trends in tuberculosis referral hospital in Addis Ababa, Ethiopia”, BMC Research Notes, 5 (462).

14. Abate G.,Miorner H. (1998), “Susceptibility of multidrug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis to amoxicillin in combination with clavulanic acid and ethambutol. ” J Antimicrob Chemother, 42, pp. 735740

15. Abdelaal A., El-Ghaffar H. A., Zaghloul M. H. E., et al. (2009),

“Genotypic detection of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial”, Ann Clin Microbiol and Antimicrob, 8 (4), doi: 10.1186/1476-0711-8-4.

16. Abe C., Kobayashi I., Mitarai S., et al. (2008), “Biological and molecular characteristics of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates with low-level resistance to isoniazid in Japan”, J Clin Microbiol, 46, pp. 2263-2268.

17. Ade’kambmi T., Drancourt M., and Raoult D. (2008), “The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists”, Trends in Microbiology, 17 (1), pp. 37-45.

18. Ahmad S., Fares E., Araj G.F., et al. (2002), “Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut”, Inter J Tuberc Lung Dis, 6 (10), pp. 920-926.
MỤC LỤC

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC B ẢNG iv

DANH MỤC B IỂU ĐỒ v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1. TỔNG QUAN 3

1.1. Bệnh lao 3

1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới 3

1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 4

1.2 . Vi khuẩn lao 4

1.2.1. Đặc điểm hình thể, cấu trúc 5

1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 6

1.2.3. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao 7

1.3. Vi khuẩn lao kháng thuốc 7

1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao hiện nay 7

1.3.2. Phân loại kháng thuốc của vi khuẩn lao 8

1.3.3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 9

1.3.3.1. Kháng rifampicin 11

1.3.3.2. Kháng isoniazid 12

1.4. Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc 13

1.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình 14

1.4.2. Phương pháp xác định kiểu gen 15

1.5. Nghiên cứu giá trị chẩn đoán của các phương pháp sinh học phân tử

trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc 18

1.5.1. Trên thế giới 18

1.5.2. Tại Việt Nam 21

1.6. Gen rpoB và katG liên quan đến kháng thuốc ở vi khuẩn lao 24

1.6.1. Gen rpoB 24

1.6.2. Gen katG 26

1.7. Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB và katG ở các chủng vi khuẩn

lao 28

1.7.1. Trên thế giới 28

1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 31

Chương 2 . ĐỐI TƯỢN G VÀ PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU 34
.1. Đối tượng nghiên cứu 34

2.2 . Địa điểm nghiên cứu 34

2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 35

2.3.1. C ác sinh phẩm hoá chất chính 35

2.3.2. C ác máy và thiết bị chính 36

2.3.3. C ác c ặp mồi dùng trong nghiên cứu 37

2.4. Phương pháp nghiên cứu 37

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 37

2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu 38

2.5.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc 40

2.5.2. T ách chiết DNA từ c ác chủng vi khuẩn nghiên cứu 41

2.5.3. Kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA 42

2.5.4. Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự 45

2.5.5. Đọc trình tự DNA trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả

bằng c ác phần mềm chuyên dụng 49

2.6. Xác định giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán

vi khuẩn lao kháng thuốc 50

2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 51

Chương 3 . KẾ T QUẢ NGHIÊN CỨU 52

3 .1. Đặc điểm phân tử gen rpoB và gen katG của các chủng vi khuẩn lao

kháng thuốc 52

3.1.1. Kết quả thu thập và và lựa chọn chủng nghiên cứu 52

3.1.2. Đ ặc điểm phân tử gen rpoB 54

3.1.3. Đ ặc điểm phân tử gen katG 64

3.2 . Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn

lao kháng đa thuốc 72

3.2.1. Đ ặc tí nh kháng thuốc của c ác chủng vi khuẩn lao thu thập được …. 72

3.2.2. Gi á trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đo án vi khuẩn

lao kháng thuốc 74

Chương 4 . BÀN LUẬN 77

4.1. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen rpoB và katG 77

4.1.1. Kết quả thu thập và lựa chọn chủng nghiên cứu 77

4.1.2. Đ ặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen rpoB 77

4.1.2.1. Số lượng và tỷ lệ đột biến trên gen rpoB ở c ác chủng vi khuẩn lao

kháng rifampicin 77

4.1.2.2. C ác vị trí đột biến trên gen rpoB ở c ác chủng vi khuẩn lao kháng

rifampicin 80.1.2.3. Tỷ lệ và kiểu đột biến trong vùng RRDR trên gen rpoB 84

4.1.2.4. C ác vị trí và kiểu đột biến mới trên gen rpoB ở c ác chủng vi khuẩn

lao kháng rifampicin 87

4.1.2.5. C ác vị trí và kiểu đột biến ngoài vùng RRDR 88

4.1.2.6. C ác kiểu kết hợp vị trí đột biến 89

4.1.3. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen katG 91

4.1.3.1. Số lượng và tỷ lệ đột biến trên gen katG ở c ác chủng vi khuẩn lao

kháng Isoniazid 91

4.1.3.2. Đột biến ở codon 315 trên gen katG (315katG) 93

4.1.3.3. C ác đột biến khác ngoài codon 315 trên gen katG 97

4.1.3.4. Tỷ lệ đột biến ở c ác chủng kháng đơn với isoniazid và kháng đa

thuốc 98

4.1.3.5. Số lượng vị trí đột biến trên đoạn gen katG được giải trình tự 99

4.1.3.6. C ác kiểu đột biến trên gen katG 100

4.2 . Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc 101

4.2.1. Đ ặc tí nh kháng thuốc của c ác chủng vi khuẩn lao thu thập được .. 101

4.2.2. Gi á trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đo án vi khuẩn

lao kháng đa thuốc 105

4.2.3. Đề xuất phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng

thuốc 107

KẾ T LUẬN 112
1. Đặc điểm phân tử gen rpoB và katG ở vi khuẩn lao kháng thuốc 112

1.1. Đ ặc điểm phân tử gen rpoB ở vi khuẩn lao kháng thuốc 112

1.2. Đặc điểm phân tử gen katG ở vi khuẩn lao kháng thuốc 112

2. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn

lao kháng đa thuốc 113

KIẾN NGHỊ 114
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN