Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP của loài viễn chí ba sừng

Luận án tiến sĩ dược học Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP của loài viễn chí ba sừng (Polygala karensium Kurz) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai.Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Trong sự phát triển về việc kết hợp y học hiện đại với y học cổ truyền, dưới ánh sáng của tri thức và khoa học công nghệ, rất nhiều cây thuốc được nghiên cứu về thành phần hóa học, để chứng minh cơ chế tác dụng của các hoạt chất có tác dụng, để giải thích cho công dụng của y học cổ truyền, kinh nghiệm dân gian, cũng như cung cấp cơ sở khoa học cho việc hiện đại hóa cây thuốc. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều cây thuốc chưa được nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học cũng như chưa nghiên cứu đầy đủ về tác dụng sinh học. Cây Viễn chí ba sừng có tên khoa học là Polygala karensium Kurz, thuộc họ Viễn chí (Polygalaceae), là cây thuốc phân bố ở một số quốc gia Châu Á như Việt Nam, Bhutan, Trung Quốc…[1]. Ở nước ta, Viễn chí ba sừng phân bố chủ yếu ở vùng núi có độ cao trên 1000m như Sapa, Tam Đảo…[2],[3].

Viễn chí ba sừng là cây thuốc được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền và theo kinh nghiệm dân gian ở cả Trung Quốc và Việt Nam. Ở Trung Quốc, rễ và vỏ cây Viễn chíba sừng được sử dụng để làm thuốc bổ tăng cường sinh lực, tăng cường trí nhớ. Người dân tộc vùng Sapa cũng dùng rễ Viễn chí ba sừng chữa các bệnh đau nhức xương khớp, bồi bổ sức khỏe và tăng cường trí nhớ cho người già, người ốm lâu ngày. Mặc dù trên thực tế cây thuốc được sử dụng có tác dụng tốt hỗ trợ chống suy giảm trí nhớ, tuy nhiên cho đến nay còn ít các nghiên cứu về thành phần hóa học và chưa có nghiên cứu tác dụng chống suy giảm trí nhớ của loài Polygala karensium Kurz được công bố ở cả Việt Nam và thế giới.
Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình ruồi giấm chuyển gen hAPP của loài viễn chí ba sừng (Polygala karensium Kurz) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai” nhằm nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Viễn chí ba sừng, từ đó tạo cơ sở khoa học cho việc giải thích công dụng của Viễn chí ba sừng trong y học cổ truyền và định hướng cho việc phát triển thuốc từ dược liệu này trong y học hiện đại.2
Đề tài được nghiên cứu với các mục tiêu sau:
1. Xác định được đặc điểm thực vật và thẩm định tên khoa học.
2. Xác định được thành phần hóa học của rễ cây Viễn chí ba sừng
3. Đánh giá được tác dụng dược lý về khả năng cải thiện trí nhớ ngắn hạn và hành vi vận động trên ruồi giấm của rễ cây Viễn chí ba sừng

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………………………………1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………………………………3
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC CỦA CHI POLYGALA VÀ LOÀI
POLYGALA KARENSIUM KURZ ……………………………………………………………………….3
1.1.Vài nét về thực vật học của chi Polygala trên thế giới và Việt Nam………………..3
1.2. Vài nét về thực vật học loài Polygala karensium Kurz………………………………….6
1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI POLYGALA VÀ LOÀI
POLYGALA KARENSIUM KURZ ……………………………………………………………………….8
1.2.1. Thành phần hóa học chi Polygala ……………………………………………………………8
1.2.2. Thành phần hóa học của loài Polygala karensium Kurz……………………………23
1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG SUY GIẢM TRÍ NHỚ CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI POLYGALA VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI POLYGALA
KARENSIUM KURZ. ……………………………………………………………………………………….26
1.3.1. Vài nét về trí nhớ và hội chứng suy giảm trí nhớ……………………………………..26
1.3.2. Một số nghiên cứu về tác dụng chống suy giảm trí nhớ của một số loài thuộc chi
Polygala……………………………………………………………………………………………………….28
1.3.3. Tác dụng sinh học của loài Polygala karensium Kurz………………………………31
1.3.4. Tổng quan về mô hình nghiên cứu tác dụng chống suy giảm trí nhớ …………33
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………36
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………36
2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu…………………………………………………………………………36
2.1.2 Động vật thí nghiệm ……………………………………………………………………………..37
2.1.3 Thuốc thử, hoá chất, dung môi, trang thiết bị nghiên cứu ………………………….38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………..402.2.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật học ……………………………………………………40
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hóa học ………………………………………………………….42
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học…………………………………………….44
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………………………………….53
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU…………………………………………………………………………53
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ …………………………………………………..55
3.1. THỰC VẬT HỌC ……………………………………………………………………………………..55
3.1.1. Thẩm định tên khoa học của Viễn chí ba sừng ………………………………………..55
3.1.2. Đặc điểm hình thái thực vật…………………………………………………………………..55
3.1.3. Đặc điểm vi học…………………………………………………………………………………..58
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ………………………………………………………………………..61
3.2.1. Kết quả định tính các nhóm hợp chất……………………………………………………..61
3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất……………………………………………………….62
3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ rễ Viễn chí ba sừng 65
3.3. TÁC DỤNG SINH HỌC…………………………………………………………………………….99
3.3.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết rễ cây Viễn chí ba sừng
đối với hành vi di chuyển của ấu trùng ruồi giấm mang gen bệnh Alzheimer hAPP…. 99
3.3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết rễ cây Viễn chí ba
sừng đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng thành mang gen bệnh Alzheimer
hAPP…………………………………………………………………………………………………………101
3.3.3. Kết quả đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm mang
gen bệnh Alzheimer hAPP của các phân đoạn cao chiết ………………………………….103
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………………………………………106
4.1. VỀ THỰC VẬT HỌC ………………………………………………………………………………106
4.2. VỀ HÓA HỌC…………………………………………………………………………………………107
4.2.1. Kết quả định tính ……………………………………………………………………………….107
4.2.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các chất………………………………………107
4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC …………………………………………………………………….115
4.3.1. Về sự phù hợp của việc sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh
Alzheimer trong đánh giá tác dụng sinh học của loài Viễn chí ba sừng ……………..115
4.3.2. Về căn cứ lựa chọn mức liều ……………………………………………………………….117
4.3.3. Về kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học………………………………………………117KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………..121
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………………………..121
1. VỀ THỰC VẬT………………………………………………………………………………………….121
2. VỀ HÓA HỌC……………………………………………………………………………………………121
3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ……………………………………………………………………….122
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………………………….123
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các saponin đã phân lập được từ các loài thuộc chi Polygala ………………………8
Bảng 1.2. Các xanthon đã phân lập được từ các loài thuộc chi Polygala ……………………13
Bảng 1.3. Các hợp chất oligosccharid đã phân lập từ các loài thuộc chi Polygala………..17
Bảng 1.4. Các hợp chất khác đã được phân lập từ các loài thuộc chi Polygala…………….19
Bảng 1.5. Cấu trúc một số hợp chất đã phân lập từ Viễn chí ba sừng …………………………25
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm hợp chất có trong rễ cây Viễn chí ba sừng ……….61
Bảng 3.2. Số liệu NMR của hợp chất VC1 và hợp chất tham khảo…………………………….66
Bảng 3.3. Số liệu NMR của hợp chất VC2 và hợp chất tham khảo……………………………69
Bảng 3.4. Số liệu NMR của hợp chất VC3 và hợp chất tham khảo…………………………….72
Bảng 3.5. Số liệu NMR của hợp chất VC4 và hợp chất tham khảo…………………………….75
Bảng 3.6. Số liệu NMR của hợp chất VC5 và hợp chất tham khảo…………………………….77
Bảng 3.7. Số liệu NMR của hợp chất VC6 và hợp chất tham khảo…………………………….79
Bảng 3.8. Số liệu NMR của hợp chất VC7 và hợp chất tham khảo…………………………….80
Bảng 3.9. Số liệu NMR của hợp chất VC8 và hợp chất tham khảo…………………………….82
Bảng 3.10. Số liệu NMR của hợp chất VC9 và hợp chất tham khảo…………………………..83
Bảng 3.11. Số liệu NMR của hợp chất VC10 và hợp chất tham khảo…………………………84
Bảng 3.12. Số liệu NMR của hợp chất VC11 và hợp chất tham khảo…………………………86
Bảng 3.13. Số liệu NMR của hợp chất VC12 và hợp chất tham khảo…………………………88
Bảng 3.14. Số liệu NMR của hợp chất VC13 và hợp chất tham khảo…………………………90
Bảng 3.15. Số liệu phổ của hợp chất VC14 và hợp chất tham khảo ……………………………92
Bảng 3.16. Số liệu NMR của hợp chất VC15 và hợp chất tham khảo…………………………93
Bảng 3.17. Số liệu NMR của hợp chất VC16 và hợp chất tham khảo …………………………94
Bảng 3.18. Số liệu NMR của hợp chất VC17 và hợp chất tham khảo …………………………96
Bảng 3.19. Vận tốc trung bình của các lô ấu trùng ruồi giấm trong thực nghiệm Crawling
assay…………………………………………………………………………………………………………………..99DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây Viễn chí ba sừng Polygala karensium Kurz ……………………………7
Hình 1.2. Cấu trúc khung của các Polygalasaponin phân lập từ chi Polygala………………11
Hình 1.3. Các hợp chất sibiricasaponin…………………………………………………………………..12
Hình 1.4. Cấu trúc khung của các onjisaponin phân lập từ chi Polygala ……………………13
Hình 1.5. Cấu trúc khung cơ bản của các xanthon phân lập từ chi Polygala ……………….16
Hình 1.6. Một số xanthon có cấu trúc đặc biệt phân lập được từ chi Polygala …………….17
Hình 1.7. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm………………………………………………..34
Hình 1.8. Vai trò của mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu sàng lọc thuốc………………35
Hình 2.1. Hình ảnh các đặc điểm chủng ruồi giấm Elav-GFP …………………………………..37
Hình 2.2. Mô hình kiểm tra trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng bậc ba ruồi giấm. ………………50
Hình 3.1. Tiêu bản mẫu Viễn chí ba sừng nghiên cứu………………………………………………56
Hình 3.2. Ảnh chụp các bộ phận của cây Viễn chí ba sừng……………………………………….57
Hình 3.3. Ảnh đặc điểm vi phẫu thân cây Viễn chí ba sừng ………………………………………58
Hình 3.4. Ảnh đặc điểm vi phẫu rễ cây Viễn chí ba sừng………………………………………….59
Hình 3.5. Ảnh đặc điểm vi phẫu của lá cây Viễn chí ba sừng ……………………………………59
Hình 3.6. Các đặc điểm của bột rễ cây Viễn chí ba sừng………………………………………….60
Hình 3.8. Sơ đồ phân lập các chất từ rễ Viễn chí ba sừng …………………………………………64
Hình 3.9. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC1…………………………………67
Hình 3.12. Phổ HR ESI MS của hợp chất VC1……………………………………………………….67
Hình 3.13. CTHH của hợp chất VC2 và hợp chất tham khảo VC1 …………………………….70
Hình 3.14. Tương tác HMBC chính của hợp chất VC2 ……………………………………………70
Hình 3.15. Phổ HR ESI MS của hợp chất VC3………………………………………………………..71
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất VC3 và hợp chất tham khảo ……………………..73
Hình 3.17. Tương tác HMBC chính của hợp chất VC3 …………………………………………….74
Hình 3.18. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC4……………………………….76
Hình 3.19. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC5………………………………78
Hình 3.20. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC6……………………………….80
Hình 3.21. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC7………………………………81
Hình 3.22. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC8……………………………….82
Hình 3.23. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC9……………………………….83Hình 3.24. CTHH và tương tác HMBC chính của hợp chất VC10……………………………..85
Hình 3.25. Phổ HR ESI MS của hợp chất VC11………………………………………………………85
Hình 3.26. CTHH của hợp chất VC11 và hợp chất tham khảo VC7 …………………………..87
Hình 3.27. Tương tác HMBC chính của hợp chất VC11 …………………………………………..87
Hình 3.28. CTHH của hợp chất VC12. …………………………………………………………………..89
Hình 3.29. CTHH của hợp chất VC13 …………………………………………………………………..91
Hình 3.30. CTHH của hợp chất VC14 ……………………………………………………………………92
Hình 3.31. CTHH của hợp chất VC15 ……………………………………………………………………94
Hình 3.32. CTHH của hợp chất VC16 ……………………………………………………………………95
Hình 3.33. CTHH của hợp chất VC17 ……………………………………………………………………96
Hình 3.34. CTHH của 17 hợp chất đã phân lập được từ rễ của loài Polygala karensium
Kurz …………………………………………………………………………………………………………………..98
Hình 3.35. Hình minh họa quãng đường di chuyển của ấu trùng bậc ba ruồi giấm ở các lô
thử nghiệm………………………………………………………………………………………………………..100
Hình 3.36. Tác dụng của Viễn chí ba sừng đối với khả năng di chuyển của ấu trùng bậc ba
ruồi giấm mang gen bệnh Alzheimer hAPP…………………………………………………………..100
Hình 3.37. Tác dụng của Viễn chí ba sừng đối với hành vi leo trèo của ruồi giấm trưởng
thành mang gen bệnh Alzheimer ở 3, 7 và 10 ngày tuổi………………………………………….102
Hình 3.38. Đánh giá khả năng ghi nhớ và học tập của các cao chiết Viễn chí ba sừng..10