Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.Chi Stephania Lour. thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) là một chi lớn, trên thế giới có khoảng 100 loài phân bố ở nhiều nước như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma, Thái Lan, Lào, Nhật Bản,… [25]. Ở Việt Nam đã công bố có khoảng 22 loài thuộc chi Stephania Lour.. Trong luận án tiến sĩ của Nguyễn Tiến Vững [48] mới nghiên cứu 3 loài: Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái ở Ninh Bình, Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Lạng Sơn, Stephania sp3. (chưa xác định được tên loài vì chưa thu được đủ hoa đực và hoa cái) thu hái ở Quảng Ninh; Luận án tiến sĩ của Nguyễn Quốc Huy [23] nghiên cứu 3 loài: Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sapa (Lào Cai), Stephania dielsiana Y. C Wu. thu hái ở Ba Vì (Hà Nội), Stephania sinica Diels thu hái ở Quảng Bình; Luận án tiến sĩ của Ngô Thị Tâm [41] nghiên cứu loài Stephania pierrei Diels mọc ở Bình Định; Luận văn cao học của Vũ Xuân Giang [20] bước đầu nghiên cứu loài Stephania viridaflavens H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Sơn La; ngoài ra, Lê Ngọc Liên, Phạm Gia Điền [30] có công bố thành phần hóa học cây bình vôi đỏ (Stephania sp.) chưa xác định rõ tên loài. Trần Thị Thủy, Trần Văn Sung [171] công bố thành phần hóa học loài Stephania rotunda thu hái ở Sơn La. Qua đó cho thấy còn nhiều loài Stephania mọc ở Việt Nam chưa được nghiên cứu đầy đủ.

Năm 2014, tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, chúng tôi thu được mẫu Bình vôi có dịch màu đỏ, được người dân địa phương sử dụng làm thuốc khớp. Cùng thời điểm đó, trên địa bàn tỉnh Văn Chấn – Yên Bái, chúng tôi cũng nhận thấy người dân địa phương đang sử dụng loài Bình vôi có dịch màu trắng (có trữ lượng lớn trên địa bàn) để sử dụng chữa mất ngủ, khớp và bệnh dạ dày. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về các mẫu Bình vôi thu hái tại hai địa phương trên. Nhằm xác minh cơ sở khoa học của việc sử dụng hai loài Bình vôi tại Bà Rịa – Vũng Tàu và Văn Chấn – Yên Bái, hướng đến việc tiêu chuẩn hóa dược liệu, tìm kiếm các hợp chất và đánh giá hoạt tính sinh học, để từ đó góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hai loài Bình vôi ở Việt Nam, luận án “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam“, đã được thực hiện với các mục tiêu:
– Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học và xác định đặc
điểm vi học hai loài bình vôi thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu và Yên Bái.
– Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài đã xác định được tên khoa học.
– Thử độc tính cấp và đánh giá một số tác dụng sinh học

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………………………….. 3
1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR. ………………. 3
1.1.1. Vị trí phân loại ………………………………………………………………………………… 3
1.1.2. Phân bố của chi Stephania Lour. ……………………………………………………….. 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR. VÀ HAI LOÀI NGHIÊN
CỨU ………………………………………………………………………………………………………….. 6
1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour. ………………………………………………. 6
1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng …………………… 7
1.2.3. Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang… 7
1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR. ……………………………… 8
1.3.1. Alcaloid ………………………………………………………………………………………….. 8
Các alcaloid nhóm benzylisoquinolin………………………………………………………….. 8
Các alcaloid nhóm bisbenzylisoquinolin ……………………………………………………… 9
Các alcaloid nhóm aporphin ……………………………………………………………………. 11
Các alcaloid nhóm proaporphin……………………………………………………………….. 15
Các alcaloid nhóm protoberberin …………………………………………………………….. 16
Các alcaloid nhóm morphinan …………………………………………………………………. 18
Các alcaloid nhóm hasubanan …………………………………………………………………. 19
Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin) ……………………………………………….. 21
Các alcaloid nhóm stephaoxocan……………………………………………………………… 21
1.3.2. Flavonoid ……………………………………………………………………………………… 21
1.3.3. Các nhóm chất khác……………………………………………………………………….. 21
1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
STEPHANIA VIRIDIFLAVENS……………………………………………………………………. 21
1.4.1. Thành phần hóa học loài Stephania venosa (Bl.) Spreng. ……………………. 21
1.4.2. Thành phần hóa học loài Stephania viridiflavens H.S. Lo & M. Yang ….. 22
1.5. TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
STEPHANIA VIRIDIFLAVENS……………………………………………………………………. 23
1.5.1. Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania venosa (Bl.) Spreng …… 23
1.5.2. Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania viridiflavens ……………… 28
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………………………………………. 29
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU………………… 29
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu………………………………………………………………….. 292.1.2. Động vật và các dòng tế bào ung thư thí nghiệm ……………………………….. 29
2.1.3. Hóa chất, dung môi………………………………………………………………………… 30
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu …………………………………………. 30
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………………. 31
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật…………………………………………………………………… 31
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học…………………………………………………… 32
2.2.3. Thử độc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học…………………………………. 33
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………………………………. 42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………………. 44
1.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT ………………………………………… 44
3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 2 loài nghiên cứu…………………………………… 44
3.1.2. Kết quả giám định tên khoa học ………………………………………………………. 50
3.1.3. Đặc điểm vi học 2 loài nghiên cứu …………………………………………………… 54
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC ………………………….. 62
3.2.1. Kết quả định tính 2 loài nghiên cứu (M1 và M2) ……………………………….. 62
3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ hai loài nghiên cứu …………………. 65
3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập……………………………….. 70
3.2.4. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần và L- tetrahydropalmatin trong củ 2
loài nghiên cứu……………………………………………………………………………………….. 99
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC100
3.3.1. Độc tính cấp của 2 loài nghiên cứu ………………………………………………… 100
3.3.2. Tác dụng giảm đau của 2 loài nghiên cứu ……………………………………….. 102
3.3.3. Tác dụng chống viêm của 2 loài nghiên cứu ……………………………………. 104
3.3.4. Hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của cao chiết tổng và
các chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu………………………………………………….. 106
3.3.5. Hoạt tính chống oxi hóa của 2 loài nghiên cứu ………………………………… 108
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN……………………………………………………………………………. 111
4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT………………………………………………………………. 111
4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC…………………………………………………………… 118
4.3. VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC……………………………….. 128
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………….. 13

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour. tại Việt Nam ……………….. 4
Bảng 1.2. Danh mục các chất thuộc nhóm benzylisoquinolin……………………………… 8
Bảng 1.3. Danh mục các chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin …………………………. 9
Bảng 1.4. Danh mục các chất thuộc nhóm aporphin ………………………………………… 11
Bảng 1.5. Danh mục các chất thuộc nhóm proaporphin ……………………………………. 16
Bảng 1.6. Danh mục các chất thuộc nhóm protoberberin………………………………….. 16
Bảng 1.7. Danh mục các chất thuộc nhóm morphinan ……………………………………… 18
Bảng 1.8. Danh mục các chất thuộc nhóm hasubanan ………………………………………. 19
Bảng 1.9. Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan …………………………………… 21
Bảng 1.10. Tác dụng sinh học của một số alcaloid có trong loài S. venosa …………. 25
Bảng 2.1. Thông tin mẫu cao chuẩn bị để thử độc tính và đánh giá tác dụng ………. 34
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong hai mẫu nghiên cứu bằng
phương pháp hóa học …………………………………………………………………………………… 62
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của SB1 (CDCl3, 500, 125 MHz, δ ppm)………………. 71
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR, HMBC của SB2 (CD3OD, 500, 125 MHz, δ ppm) … 73
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hỗn hợp 2 chất trong SB3 và chất tham khảo …… 74
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SB4 và chất tham khảo Stepharin …………………… 75
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của chất SE1 và chất tham khảo [23] ……………………. 77
Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của SE3 và chất tham khảo Stephanin ………………….. 80
Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của SE5 và chất tham khảo………………………………….. 81
Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của SE6 (SDLE1.1) và chất tham khảo…………………. 83
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của chất SE7 và chất tham khảo [59] ………………….. 85
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR của chất SE8 và chất tham khảo [145] ……………. 86
Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 13C-NMR của chất SE8 và chất tham khảo [140]…………… 87
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của chất SE9 và chất tham khảo…………………………. 89
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ của SVB7 so với chất tham khảo…………………………………. 91
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ NMR của SVB6.1 và chất tham khảo ………………………….. 92
Bảng 3.16. Dữ liệu phổ của SVB12 và chất tham khảo…………………………………….. 93
Bảng 3.17. Dữ liệu phổ NMR của SVB13.1 và tham khảo ……………………………….. 95
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của SVB8 so với chất tham khảo ……………………….. 98
Bảng 3.19. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong củ 2 loài nghiên cứu…….. 99
Bảng 3.20. Số lượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV1 ở các mức liều thử
………………………………………………………………………………………………………………… 100Bảng 3.21. Số lượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV2 ở các mức liều thử.
………………………………………………………………………………………………………………… 101
Bảng 3.22. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn……………………………… 102
Bảng 3.23. Tác dụng giảm đau trên mô hình mâm nóng …………………………………. 104
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên mức độ phù chân chuột theo thời
gian ………………………………………………………………………………………………………….. 104
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên khối lượng u hạt trên chuột cống
trắng…………………………………………………………………………………………………………. 105
Bảng 3.26. Tác động gây độc tế bào ung thư của các mẫu nghiên cứu ……………… 107
Bảng 3.27. Hoạt tính chống oxi hóa (%) của các mẫu nghiên cứu……………………. 108
Bảng 4.1. Đặc điểm làm cơ sở giám định tên khoa học [170]………………………….. 112
Bảng 4.2. So sánh tiêu bản loài nghiên cứu mẫu M1 với tiêu bản ơ các phòng tiêu bản
(PTB) nước ngoài………………………………………………………………………………………. 114
Bảng 4.3. So sánh đặc điểm thực vật giữa 2 loài S. venosa (Bl.) Spreng và S.dielsiana
Y.C.Wu [23] ……………………………………………………………………………………………… 115
Bảng 4.4. Hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ của một số loài Bình vôi ở Việt
Nam …………………………………………………………………………………………………………. 126DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi…………………………. 35
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương…………………….. 36
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp ……………………………. 37
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá tác dụng chống viêm mạn…………………………… 39
Hình 3.1. Đặc điểm củ và lá của loài M1………………………………………………………… 44
Hình 3.2. Đặc điểm hoa đực của loài M1 ……………………………………………………….. 45
Hình 3.3. Đặc điểm hoa cái và quả của loài M1 ………………………………………………. 46
Hình 3.4. Đặc điểm củ và lá loài M2 ……………………………………………………………… 47
Hình 3.5. Đặc điểm hoa đực loài M2 ……………………………………………………………… 48
Hình 3.6. Đặc điểm hoa cái và quả của loài M2 ………………………………………………. 50
Hình 3.7. Đặc điểm hình thái loài Stephania venosa (Bl.) Spreng (mẫu M1) thu hái
tại Bà Rịa Vũng Tàu…………………………………………………………………………………….. 52
Hình 3.8. Đặc điểm hình thái loài Stephania viridiflavens H.S. Lo & M. Yang (mẫu
M2) thu hái tại Văn Chấn, Yên Bái………………………………………………………………… 53
Hình 3.9. Vi phẫu thân loài S. venosa…………………………………………………………….. 54
Hình 3.10. Vi phẫu cuống lá loài S. venosa …………………………………………………….. 55
Hình 3.11. Đặc điểm vi phẫu lá của loài S. venosa…………………………………………… 55
Hình 3.12. Một số đặc điểm trong bột củ loài S. venosa …………………………………… 56
Hình 3.13. Một số đặc điểm trong bột lá loài S. venosa ……………………………………. 57
Hình 3.14. Vi phẫu thân loài S. viridiflavens …………………………………………………… 58
Hình 3.15. Vi phẫu cuống lá loài S. viridiflavens …………………………………………….. 59
Hình 3.16. Vi phẫu lá loài S. viridiflavens ………………………………………………………. 60
Hình 3.17. Một số đặc điểm trong bột củ loài S. viridiflavens …………………………… 61
Hình 3.18. Một số đặc điểm trong bột lá loài S. viridiflavens ……………………………. 61
Hình 3.19. Hình ảnh sắc ký đồ TLC của dịch chiết mẫu M1 và M2 …………………… 64
Hình 3.20. Sơ đồ chiết xuất củ S. venosa………………………………………………………… 66
Hình 3.21. Sơ đồ phân lập các chất từ 66g cắn BuOH ……………………………………… 67
Hình 3.22. Sơ đồ phân lập các chất từ 40,5g cắn EtOAc…………………………………… 67
Hình 3.23. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ củ S. viridiflavens ………………. 69
Hình 3.24. Sơ đồ phân lập các chất từ 52g cắn BuOH ……………………………………… 69
Hình 3.25. Sơ đồ phân lập các chất từ 83,2g cắn CH2Cl2………………………………….. 70
Hình 3.26. Cấu trúc hóa học các chất SB1 (palmatin) ………………………………………. 71
Hình 3.27. Cấu trúc hóa học và tương tác NOESY của chất SB2 (jatrorrhizin) …… 72Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất trong SB3…………………………………….. 74
Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của SB4 (stepharin) …………………………………………….. 75
Hình 3.30. Cấu trúc của SE1 (dehydrocrebanin) ……………………………………………… 77
Hình 3.31. Cấu trúc của SE2 (hỗn hợp của các acid béo) ………………………………….. 78
Hình 3.32. Cấu trúc của SE3 (stephanin)………………………………………………………… 79
Hình 3.33. Cấu trúc của SE5 (crebanin) …………………………………………………………. 81
Hình 3.34. Cấu trúc của SE6 (SDLE1.1) (O-Methylbulbocapnin) ……………………… 83
Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của SE7 (L – tetrahydropalmatin) …………………………. 84
Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của SE8 (β-sitosterol)………………………………………….. 86
Hình 3.37. Cấu trúc của SE9 (β-sitosterol-3-O- β –D-glucopyranosid) ………………. 89
Hình 3.38. Một số tương tác HMBC chính (H→C) và cấu trúc hóa học của SVB7
(roemerin) …………………………………………………………………………………………………… 90
Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính (H→C) của SVB6.1
(thaicanin)…………………………………………………………………………………………………… 92
Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của SVB12 (stepharin) ………………………………………… 93
Hình 3.41. Cấu trúc của SVB13.1 (liriodenin) ………………………………………………… 95
Hình 3.42. Cấu trúc của SVB2 (capaurin) ………………………………………………………. 97
Hình 3.43. Cấu trúc của SVB8 (roseosid)……………………………………………………….. 98
Hình 4.1. Cấu trúc 20 hợp chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu: S. venosa và S.
viridiflavens………………………………………………………………………………………………. 12