Nghiên cứu định lượng kháng nguyên CD33 trong huyết thanh bằng kháng thể tái tổ hợp với phương pháp Real – time PCR

Mục tiêu: Chuẩn hóa phương pháp định lượng CD33 dựa trên việc kết hợp độ nhạy cảm của kỹ thuật real-time PCR, sự đặc hiệu của kháng nguyên – kháng thể với kỹ thuật phage display và bước đầu định lượng CD33 trên một số bệnh nhân leukemia cấp. Phương pháp nghiên cứu: Chuẩn hóa kỹ thuật, xác đinh độ nhạy và định lượng CD33 trong huyết thanh môt số Bệnh nhân leukemia dạng cấp. Kết quả nghiên cứu: Trên các mẫu thử định lượng CD33 cho kết quả tương ứng với mức độ định lượng sơ bộ bằng ELISA, độ nhạy của phương pháp cho phép định lượng kháng nguyên CD33 trong huyết thanh ở mức nanogram. Bước đầu xác định nồng độ CD33 ở 11 mẫu huyết thanh của bệnh nhân được chẩn đoán leukemia cấp
Từ khóa: Anti-CD33 antibody, Phage antibody, Phage display Real-time Immuno- PCR.
2.    Đặt vấn đề
Bệnh bạch cầu được chia làm 4 dạng (Head, 1996; Willman, et al. 1999): Nguyên Bào Cấp Tính (Acute Lymphoblastic Leukaemia-ALL); Bạch Huyết Bào Mạn tính (Chronic Lymphocytic Leukaemia-CLL); Tủy Bào Cấp Tính (Acute Myeloid Leukaemia-AML); Tủy Bào Mạn tính (Chronic Myeloid Leukaemia-CML).
Tủy bào cấp tính có các tên gọi theo tiếng Anh là: Acute myeloid leukaemia-(AML); acute myelocytic, acute hay acute myelogenous leukaemia. Kháng nguyên CD33 có sự biểu hiện quá mức ở 90% các tế bào Leukemic blast của bệnh nhân mắc bệnh AML, nhưng không biểu hiện trên các tế bào gốc tạo máu bình thường cũng như các tế bào của các mô không tạo máu (Hernandez-Caselles, et al. 2006; Paul et al. 2000; Vitale et al. 2001). Kháng nguyên CD33 được coi là một chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp tính, nó cho phép phân biệt giữa các tế bào tủy xương cấp tính với các tế bào gốc bình thường.
Việc nghiên cứu xây dựng các phương pháp xác định sớm, chính xác kháng nguyên CD33 trong huyết thanh đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh. Kỹ thuật real-time PCR cho phép định lượng chính xác các bản sao ADN trong mẫu phân tích nhưng không định lượng được protein. Sử dụng kỹ thuật real-time PCR để định lượng protein (mà trong kỹ thuật này là CD33) thông qua phức hệ Protein-ADN. Đây là một hướng nghiên cứu mới trong miễn dịch phân tử. Tác giả Lê Quang Huấn cùng nhóm nghiên cứu đã tạo được phức hệ kháng thể-ADN dưới dạng kháng thể-phage, tức là các kháng thể CD33 được biểu lộ trên bề mặt phage. Các hạt phage có đặc tính độc nhất vô nhị là sự liên kết hữu cơ giữa kiểu hình (peptide biểu lộ trên bề mặt phage) và kiểu gen (ADN mã hóa peptide đã được biểu lộ trên bề mặt phage). Do vậy, kháng thể- phage đặc hiệu kháng nguyên CD33 vừa được sử dụng như kháng thể tóm bắt kháng nguyên, vừa được sử dụng như khuôn để khuếch đại gen trong phản ứng real-time PCR. Lượng kháng nguyên trong mẫu phân tích được định lượng gián tiếp qua kết quả khuếch đại gen. Phương pháp này có sự kết hợp độ đặc hiệu phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể với độ nhạy của các kỹ thuật real-
time PCR và kỹ thuật phage display. Phương pháp này được gọi là PDRTI-PCR (Phage Display Real-time Immuno-PCR).
3.    Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu: Thư viện kháng thể phage (của Trung tâm công nghệ protein của Vương Quốc Anh). Phức hệ kháng thể-ADN dưới dạng scFv của kháng thể biểu lộ trên phage (gọi tắt là kháng thể phage) có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD33 do Phòng Công nghệ tế bào động vật thuộc Viện Công nghệ sinh học tạo ra. Kháng nguyên CD33 chuẩn. Các mẫu bệnh phẩm ung thư dạng tiền tủy cấp do Bệnh Viện Bạch Mai cung cấp. QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix (Roche) và các hóa chất khác đều có độ tinh khiết cao đảm bảo cho các thí nghiệm về sinh học phân tử và công nghệ gen. Các máy móc và thiết bị như máy ly tâm, máy nhân gen PCR, máy Mastercycler ep reaplex 2.0 (Eppendoft) sử dụng cho real-time PCR, máy đo phổ hấp thụ “Thermo-Labsystems Multiskan Ascent” sử dụng cho ELISA, Nanodrop-1000 để xác định nồng độ ADN và nồng độ Protein và các máy móc thiết bị khác thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen của Viện Công nghệ sinh học.
Phương pháp : Kỹ thuật ELISA (phản ứng định lượng sơ bộ)
Nguyên tắc: Dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên CD33 có trong huyết thanh với kháng thể phage và kháng thể cộng hợp (kháng thể kháng phage gắn enzyme) Enzyme sẽ thủy phân cơ chất TBM trong môi trường phản ứng tạo thành hợp chất màu xanh. Nồng độ màu tỷ lệ thuận với hoạt độ enzyme và nồng độ kháng nguyên.
Cách tiến hành: Phủ 100 ụl dịch huyết thanh bệnh nhân vào mỗi giếng của khay thử 96 giếng, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần với PBS. Bổ sung vào mỗi giếng 200 ụ,l 2% MPBS, ủ 2 giờ ở 370C. Rửa 5 lần với PBS. Thêm 100 ụ,l phage vào mỗi giếng, ủ 90 phút ở nhiệt độ phòng .Rửa 5 lần với TPBS 0,01%, rửa 5 lần với PBS. Bổ sung 100 ụ,l kháng thể cộng hợp vào mỗi giếng, ủ nhiệt độ phòng 90 phút.Rửa 3 lần với TPBS 0,01%, rửa 3 lần với PBS. Bổ sung vào mỗi giếng 100 ụ,l TMB.Sau 10 phút bổ sung 50 ụ,l H2SO4 2N để dừng phản ứng. Đo OD450 và OD650, tính hiệu OD450 – OD650