Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật

Luận vănNghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật.Tiền sản giật là tình trạng bệnh lý do thai nghén gây ra, đây là một rối loạn nghiêm trọng thường biểu hiện sau tuần thứ 20 của thai kỳ, được xác định là có tăng huyết áp, protein niệu hoặc đi kèm theo phù và có thể kèm theo các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng khác [1],[2],[3]. Tiền sản giật xảy ra ở tất cả các nước trên thế giới, cả ở các nước phát triển và đang phát triển, tỷ lệ mắc tiền sản giật ở các thai phụ khoảng 2 – 8%.

Tiền sản giật tác động nhiều đến mẹ và thai nhi, hậu quả có thể gây biến chứng nặng cho mẹ: sản giật, rau bong non, rối loạn đông máu, suy gan, suy thận,…., cho đến nay tiền sản giật vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho mẹ; đối với thai nhi có thể gây hậu quả: thai chậm phát triển, suy thai, …
Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các kỹ thuật sinh học phân tử không ngừng được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học. Việc phát hiện ra DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai phụ đã mở ra một hướng mới đó là chẩn đoán trước sinh bằng các kỹ thuật không xâm lấn [4]. Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương, huyết thanh thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai, tăng cao bất thường liên quan đến các biến chứng của thai kỳ (tiền sản giật, đẻ non, thai lệch bội nhiễm sắc thể 21, …) và được thải trừ nhanh chóng sau sinh [5],[6]. Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tăng cao có ý nghĩa lần đầu tiên từ tuần thai thứ 17 và lần thứ 2 vào thời điểm 3 tuần trước khi có triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật [7]. Điều này gợi ý khả năng ứng dụng kỹ thuật định lượng DNA phôi thai tự do để sàng lọc và phát hiện sớm các thai phụ có nguy cơ tiền sản giật. Một số nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng được DNA thai từ tuần thứ 5 và 6 của thai kỳ và trên cơ sở kỹ thuật này đã được áp dụng vào chẩn đoán trước sinh không xâm lấn một cách chính xác và hiệu quả hơn trong việc theo dõi, dự đoán các nguy cơ của cả mẹ và thai nhi trong quá trình thai nghén [8],[9],[10].
Ở Việt Nam, hiện tại chẩn đoán tiền sản giật dựa vào triệu chứng của bệnh: huyết áp cao, protein niệu, … bên cạnh đó việc theo dõi phát hiện tiền sản giật dựa vào các triệu chứng của bệnh nhân phát hiện ra và tự đến khám: phù, nhức đầu,… Các xét nghiệm sàng lọc định lượng các dấu ấn như aFP, HCG, uE3 … nhưng tính đặc hiệu, chẩn đoán và theo dõi dọc không cao [11]. Với mục đích nghiên cứu vai trò của DNA phôi thai tự do trong tiền sản giật để giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm một dấu ấn sinh học trong dự báo sớm, theo dõi và tiên lượng tiền sản giật nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật” với các mục tiêu sau:
1. Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ.
2. Đánh giá nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật.

MỤC LỤC
Mục lục
Đặt vấn đề 1
Chương 1. Tổng quan 3
1.1. Tổng quan về DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương 3
thai phụ
1.1.1. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do 3
1.1.2. Kích thước của DNA phôi thai tự do 7
1.1.3. Thời gian bán hủy t/2 của DNA phôi thai tự do 8
1.1.4. Tình hình nghiên cứu DNA phôi thai tự do ở nước ngoài và ở Việt 9
Nam
1.2. Tổng quan về tiền sản giật 14
1.2.1. Khái niệm tiền sản giật 14
1.2.2. Yếu tố nguy cơ và cơ chế bệnh sinh của tiền sản giật 15
1.2.3. Một số triệu chứng điển hình của tiền sản giật 19
1.2.4. Phân loại và chẩn đoán tiền sản giật 20
1.2.5. Tiên lượng 21
1.2.6. Các biến chứng của tiền sản giật 21
1.2.7. Một số dấu ấn sinh học được sử dụng trong chẩn đoán, theo dõi 24
tiền sản giật
1.3. Kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA 26
1.3.1. Kỹ thuật PCR 26
1.3.2. Kỹ thuật Realtime PCR 28
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 38
2.1. Đối tượng nghiên cứu 38
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu 38
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 39
2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 39
2.3. Phương pháp nghiên cứu 39
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 39
2.3.2. Các bước tiến hành nghiên cứu 40
2.3.3. Các chỉ số cần xác định trong nghiên cứu 43
2.3.4. Kỹ thuật xác định các chỉ số trong nghiên cứu 43
2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 51
2.5. Trang thiết bị và máy móc phục vụ nghiên cứu 52
2.6. Phương pháp phân tích số liệu 52
2.7. Đạo đức nghiên cứu 53
Chương 3. Kết quả nghiên cứu 54
3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 54
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và huyết áp 54
3.1.2. Tuổi thai của đối tượng nghiên cứu 54
3.1.3. Đặc điểm về tỷ lệ phù 55
3.1.4. Một số đặc điểm về huyết học 56
3.1.5. Một số đặc điểm về hóa sinh máu cơ bản 58
3.1.6. Phân bố mức protein niệu 58
3.1.7. Một số đặc điểm của trẻ sơ sinh ở các sản phụ bình thường và tiền 59
sản giật
3.2. Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime 60
PCR để định lượng DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ
3.2.1. Chiết tách DNA 60
3.2.2. Thực hiện kỹ thuật PCR lồng để phát hiện DNA sau chiết tách 60
3.2.3. Thực hiện kỹ thuật PCR lồng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen 62
cần định lượng trong huyết tương thai phụ
3.2.4. Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR 63 để định lượng DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ
3.3. Định lượng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR
3.3.1. Định lượng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bình thường
3.3.2. Định lượng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tiền sản giật
3.3.3. Xác định sự thay đổi nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật
Chương 4. Bàn luận
4.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
4.2. Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ
4.2.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA phôi thai tự do theo quy trình của Randen I. và CS
4.2.2. Kết quả của PCR lồng kiểm tra DNA sau chiết tách
4.2.3. Kết quả của PCR lồng để phát hiện đoạn gen cần định lượng
4.2.4. Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR
4.3. Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương mẹ ở nhóm thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật, ứng dụng trong dự báo sớm tiền sản giật
4.3.1. Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bình thường
4.3.2. Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tiền sản giật
Kết luận Kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục