Nghiên cứu đột biến của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu đột biến của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình. Ung thư đại trực tràng là bệnh lý ác tính phổ biến với khoảng 655.000 người chết trên thế giới mỗi năm. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng là 7,5/100.000 dân, đứng hàng thứ 5 ở cả hai giới sau ung thư phế quản, dạ dày, gan và vú; ở nam giới, ung thư đại trực tràng đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi. Theo Nguyễn Văn Hiếu (2007), tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng ở nam nhiều hơn nữ [6].
Hầu hết ung thư đại trực tràng có liên quan đến các yếu tố nguy cơ ngoại sinh, chỉ một số ít yếu tố nguy cơ do di truyền. Ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình là một ung thư bắt nguồn từ bệnh đa polyp tuyến gia đình (familial adenomatous polyposis: FAP), là một bệnh di truyền trội với nhiều các polyp trong đại trực tràng. Các polyp này ban đầu là lành tính nhưng về sau có thể trở thành ác tính nếu không được điều trị. Bệnh sinh của ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình được cho là do đột biến của gen APC (adenomatous polyposis coli), một gen ức chế ung thư đa chức năng.

Tuy ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình chỉ chiếm tỷ lệ khoảng 1% trong ung thư đại trực tràng nói chung nhưng có ý nghĩa quan trọng vì đây là bệnh có khả năng di truyền cao.
Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u đa chức năng nằm trên nhiễm sắc thể 5q21. Sản phẩm của gen APC là một protein gồm 2.843 acid amin, có khả năng gắn với nhiều loại protein khác nhau như β-catechin, actin, CtBP, Asef, IQGAP1, EB1 và với nhiều vi cấu trúc hình ống. Groden và cộng sự (1991), Powel và cộng sự (1992), Ross và Groden (2000) đã chỉ ra rằng đột biến ở gen APC là một trong những nguyên nhân gây bệnh đa polyp tuyến gia đình và ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình [58], [59], [102].2
Bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình là bệnh lý di truyền. Tỷ lệ đột biến gen APC trong các gia đình FAP khá cao, chiếm 80- 85% [46], [54]. Do vậy, việc xác định các đột biến ở gen APC ở các thành viên của gia đình bệnh nhân góp phần theo dõi và phát hiện sớm các đối tượng có nguy cơ mắc bệnh, định hướng trong chẩn đoán và điều trị dự phòng nguy cơ tiến triển thành ung thư.
Đột biến tế bào sinh dục (germline mutations), đột biến được phát hiện ở các tế bào bạch cầu là đột biến phổ biến nhất, chiếm tỷ lệ 85% tổng số đột biến của gen APC. Theo González S (2005) và Michils G (2005), các đột biến điểm được phát hiện thấy ở 60-70% bệnh nhân FAP [56], [84]. Đột biến mất đoạn lớn được xác định ở 10-15% bệnh nhân [56], [84], [95]. Nuria GosmezFernandez (2009), Jian-Qiu Sheng (2010) dùng kỹ thuật giải trình tự gen kết
hợp với kỹ thuật MLPA hoặc PCR định lượng để xác định đột biến mất đoạn gen, lặp đoạn [71], [99]. Exon 15 là vùng hay xảy ra đột biến nhất chiếm khoảng 90% đột biến tế bào sinh dục của gen APC chính vì vậy các nhà khoa học thường tập trung xác định đột biến ở exon 15 [61],[71], [99].
Ở Việt nam hiện chưa có nghiên cứu nào được tiến hành để xác định các đột biến ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đột biến của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình” nhằm hai mục tiêu:
1. Xác định đột biến trên exon 15 của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
2. Phát hiện các đột biến trên exon 15 của gen APC ở các thành viên có quan hệ huyết thống với bệnh nhân mang gen đột biến

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………….. 1
CHƢƠNG 1 ……………………………………………………………………………………… 3
TỔNG QUAN …………………………………………………………………………………… 3
1.1. Ung thƣ đại trực tràng……………………………………………………………….. 3
1.1.1. Đại cƣơng về ung thƣ đại trực tràng ……………………………………………. 3
1.1.2. Giải phẫu đại tràng và trực tràng………………………………………………….. 4
1.1.3. Chẩn đoán ……………………………………………………………………………….. 4
1.1.4. Điều trị ung thƣ đại tràng……………………………………………………………. 7
1.1.5. Điều trị ung thƣ trực tràng ………………………………………………………….. 7
1.1.6. Tầm soát ung thƣ đại trực tràng …………………………………………………… 8
1.2. Bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP)……………………………………………. 9
1.2.1. Dấu hiệu và triệu chứng……………………………………………………………… 9
1.2.2. Chẩn đoán ……………………………………………………………………………… 11
1.2.3. Xét nghiệm di truyền ……………………………………………………………….. 14
1.2.4. Điều trị ………………………………………………………………………………….. 14
1.2.5. Phòng bệnh…………………………………………………………………………….. 15
1.2.6. Di truyền học………………………………………………………………………….. 16
1.3. Cấu trúc của gen APC và protein APC……………………………………….. 17
1.3.1. Cấu trúc của gen APC………………………………………………………………. 17
1.3.2. Cấu trúc của protein APC …………………………………………………………. 18
1.3.3. Các chức năng của gen APC và protein APC……………………………….. 20
1.3.4. Các đột biến ở gen APC và bệnh lý liên quan ………………………………. 26
1.4. Các kỹ thuật xác định đột biến ở gen APC ………………………………….. 28
1.4.1. Kỹ thuật PCR ………………………………………………………………………… 281.4.2. Real-time PCR………………………………………………………………………… 31
1.4.3. Kỹ thuật MLPA ……………………………………………………………………….. 32
1.4.4. Kỹ thuật huỳnh quang lai tại chỗ ………………………………………………. 34
1.4.5. Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động………………………………… 36
CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………. 37
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ……………………………………………………………… 37
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu ……………………………. 38
2.2.1. Dụng cụ…………………………………………………………………………………. 38
2.2.2. Hoá chất ………………………………………………………………………………… 38
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu: ………………………………………………………… 40
2.3.1. Quy trình lấy mẫu……………………………………………………………………. 40
2.3.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi ………………………………….. 40
2.3.3. Phƣơng pháp quang phổ …………………………………………………………… 42
2.3.4. Điện di DNA sau tách chiết ………………………………………………………. 42
2.3.5. Kỹ thuật PCR để khuếch đại exon 15 của gen………………………………. 43
2.3.6. Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ……………………………………….. 46
2.3.7. Tinh sạch đoạn DNA từ gel agarose …………………………………………… 48
2.3.8. Giải trình tự gen ……………………………………………………………………… 50
2.3.9. Phân tích tiền sử gia đình của các bệnh nhân ……………………………….. 51
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu………………………………………………. 52
CHƢƠNG 3 ……………………………………………………………………………………. 53
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………………………… 53
3.1. Kết quả tách chiết DNA…………………………………………………………… 53
3.2. Kết quả xác định đột biến gen APC ở các gia đình bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình …………………………………………. 543.3. Kết quả phân tích gen APC ở các thành viên gia đình bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình ………………………………………….. 76
3.4. Kết quả phân tích gen APC của nhóm đối chứng…………………………….. 77
CHƢƠNG 4 ……………………………………………………………………………………. 81
BÀN LUẬN……………………………………………………………………………………. 81
KẾT LUẬN…………………………………………………………………………………… 110
KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………………….. 111
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ……. 112
TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………….. 11