Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
Luận án tiến sĩ y họcNghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương.Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Betaglobin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%… (Saovaros Svasti, Hieu et al. 2002). Bệnh nhân là những người mang 2 đột biến gen thalassemia (đồng hợp tử) hoặc thalassemia kết hợp với HbE. Biểu hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da… do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên 2001).
Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp. Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β
Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốnsinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm. Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia.Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân. Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007).
Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan, Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al. 1986, Park,Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al. 2004). Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu genlà kiểu hình trên bệnh nhân thalassemia (Galanello, Ruggeri et al. 1983,Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai,Munkongdee et al. 2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009,Nuinoon, Makarasara et al. 2010). Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấndi truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan etal. 2001).
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh thalassemia nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắctố. Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏngcao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủđể đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của
người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” đượcthực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau:3
1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia vàngười mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR và giải trình tự gen Sanger.
2. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối
MỤC LỤC Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………..4
1.1. Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin…………………………………………4
1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường ……………………………………………..4
1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin ……………………………………………………………..5
1.2. Bệnh thalassemia…………………………………………………………………………..6
1.2.1. Khái niệm………………………………………………………………………………… 6
1.2.2. Dịch tễ học bệnh thalassemia……………………………………………………. 6
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh ………………………………………………………………………. 6
1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia…………………………………………. 9
1.2.5. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh thalassemia …………………………………. 10
1.2.6. Chẩn đoán bệnh thalassemia…………………………………………………… 10
1.3. Đột biến gen globin………………………………………………………………………11
1.3.1. Cấu trúc gen globin……………………………………………………………….. 11
1.3.2. Các dạng đột biến trên gen globin và một vài cơ chế đột biến
trong tổng hợp chuỗi globin……………………………………………………. 13
1.3.3. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ………………………………………. 15
1.3.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin …… 16
1.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh ………………………………………….. 22
1.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia ………………………………………..23
1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ……………………………………… 24
1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling – CVS)…………………………………….24
1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis – PGD) …………….26
1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh thalassemia tại Việt Nam……………………..26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………28
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ……………………………………………………28iv
2.2. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………..28
2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh thalassemia thể nặng …………………………. 28
2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh thalassemia ………………………………… 28
2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ………………………………………………… 29
2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân……………………………………………………….29
2.4. Trang thiết bị cần thiết……………………………………………………………………29
2.4.1. Trang thiết bị ………………………………………………………………………….. 29
2.4.2. Hóa chất ………………………………………………………………………………… 29
2.5. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………………..32
2.6. Quy trình xác định đột biến gen globin………………………………………….32
2.6.1. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi ………………….. 32
2.6.2. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối ……………….. 33
2.6.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose…………………………………. 33
2.6.4. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin ………………………… 34
2.6.5. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin…………. 36
2.6.6. Kỹ thuật Gap PCR…………………………………………………………………… 37
2.6.7. Nuôi cấy tế bào ối……………………………………………………………………. 37
2.7. Vấn đề đạo đức………………………………………………………………………………38
2.8. Sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………………………………………39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………..40
3.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu……………………………………………………….40
3.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin …………………………………………….40
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA……………………………………………………………. 40
3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc thalassemia thể nặng………48
3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen
bệnh thalassemia…………………………………………………………………… 67v
3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia…………………………. 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………..88
4.1. Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và
Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh thalassemia ……………………88
4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ………………………………………………… 88
4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ……………………………………………….. 90
4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR…………………………………………………………………… 91
4.2. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen globin trên
nhân thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương…………………………….91
4.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR ……………………….. 91
4.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân thalassemia
tại bệnh viện Nhi Trung ương. …………………………………………………… 92
4.2.3. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt…………………………… 93
4.3. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen globin trên người mang gen
thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương …………………………………….97
4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia ………………………………………100
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………………………..103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN………………………………………………………………………..104
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH …………………………………………….105
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………………116
PHỤ LỤC