Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen Dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy – DMD) hay bệnh teo cơ giả phì đại là một bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính. Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen Dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 2400 Kb, mã hóa 14-kb mRNA, bao gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Protein mã hóa bởi gen này là Dystrophin, nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ không bị tổn thương trong quá trình co cơ.
Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến; hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ: biểu hiện là khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết ở lứa tuổi 20 ^ 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp.
Bệnh DMD chiếm tỉ lệ mắc cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500 trẻ trai), biểu hiện bệnh rất nặng, tử vong sớm cùng với rối loạn về tinh thần; bệnh đã gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh và cộng đồng xã hội. Bởi vậy, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu nhằm tìm ra giải pháp tốt nhất đối phó với căn bệnh này. Việc chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán người mang gen gây bệnh đã được thực hiện trên toàn thế giới, từ đó có thể đưa ra những lời khuyên di truyền nhằm giảm tỉ lệ mắc bệnh.
Cho đến nay bản đồ đột biến gen Dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất, với hai vùng đột biến mất đoạn trọng điểm (hotspot region) chiếm trên 60% tỉ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp và chiếm 25-30%, đột biến lặp đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn khoảng 10-15%.
Ở Việt Nam, trong những năm trước đây, bệnh DMD đã được nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ và giá trị enzym Creatine Kinase (CK) huyết thanh trong chẩn đoán, đặc biệt là chẩn đoán sớm khi chưa có dấu hiệu lâm sàng và phát hiện người lành mang gen gây bệnh. Tuy nhiên, hầu hết những kết quả này chỉ mang tính chất gợi ý, chưa có bằng chứng rõ ràng về tổn thương ở mức độ di truyền, do đó kết quả chưa có sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền [16]. Giai đoạn 1998-2003, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân tử nhưng hầu hết mới mang tính chất thăm dò trên số lượng ít bệnh nhân. Năm 2004, nhờ sự hợp tác giữa Bệnh viện Nhi Trung ương và GS. Masafumi Matsuo – Nhật Bản, một nghiên cứu nhằm xác định đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD đã được thực hiện với cỡ mẫu nhiều hơn và có hệ thống, gần 100 bệnh nhân DMD được tiến hành phân tích gen. Tuy nhiên, do khó khăn trong việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, những bệnh nhân này mới chỉ được xác định đột biến ở mức độ DNA sử dụng 19 cặp mồi để khuyếch đại 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn (trong tổng số 79 exon) trên gen Dystrophin mà chưa khuyếch đại 60 exon còn lại; và kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỉ lệ thường gặp là 60%. Điều này chứng tỏ rằng khoảng gần 30% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD được nghiên cứu ở Việt Nam. Như vậy, việc xác định đột biến ở 60 exon còn lại là cần thiết. Tuy nhiên, muốn xác định đột biến ở mức độ DNA với 60 exon còn lại chúng ta phải thiết kế thêm 60 cặp mồi, trong khi đó nếu chẩn đoán ở mức độ mRNA thì chỉ với 15 cặp mồi đã có thể khuyếch đại được toàn bộ chiều dài gen Dystrophin. Vì vậy, xác định đột biến ở mức độ mRNA sẽ tiết kiệm được
công sức, hoá    chất,    thời    gian và có thể    xác    định    được toàn bộ    đột    biến    mất đoạn trên gen Dystrophin ở bệnh nhân DMD.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen Dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne” được thực hiện nhằm mục tiêu:
Xác định tỷ lệ mất đoạn từng exon và tỷ lệ phân bố vùng đột biến mất đoạn của gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ    1
Chương 1: TỔNG    QUAN    4
1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD    4
1.2.    Đặc điểm bệnh DMD    5
1.2.1    Đặc điểm    lâm    sàng    của bệnh DMD    5
1.2.2.    Xét nghiệm cận lâm sàng    6
1.2.3.    Điều trị bệnh DMD    7
1.2.4.    Phòng bệnh DMD    8
1.3.    Cơ chế di truyền của bệnh DMD    8
1.4.    Tần số của bệnh DMD    10
1.5.    Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen Dystrophin    10
1.5.1    Vị trí của gen Dystrophin    10
1.5.2.    Cấu trúc và chức năng của gen Dystrophin    11
1.6.    Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin    12
1.7.    Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin    13
1.7.1.    Đột biến mất đoạn gen Dystrophin    13
1.7.2.    Đột biến điểm    14
1.7.3.    Đột biến lặp đoạn trong gen Dystrophin    14
1.8.    Các phương pháp phát hiện đột biến gen Dystrophin    15
1.8.1.    Kỹ    thuật polymerase chain reaction (PCR)    15
1.8.2.    Phản ứng Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)     16
1.8.3.    Phản ứng multiplex PCR    18
1.8.4.    Phương pháp lai Southern blots    18
1.8.5.    Giải trình tự gen (DNA sequencing)    19
1.9.    Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở các nước trên thế giới    19
1.10.    Những nghiên cứu về DMD ở Việt Nam    20
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    23
2.1.    Đối tượng nghiên cứu    23
2.2.    Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu    23
2.2.1.    Dụng cụ    23
2.2.2.    Hóa chất    24
2.3.    Phương pháp nghiên cứu    25
2.3.1.    Quy trình lấy mẫu    25
2.3.2.    Quy trình tách chiết RNA tổng số từ 10 ml máu    ngoại vi    25
2.3.3.    Quy trình RT-PCR tổng hợp cDNA    27
2.3.4.    Phản ứng Nested-PCR xác định đột biến    29
2.3.5.    Kỹ thuật điện di trên gel agarose    32
2.3.6.    Nhân dòng gen (cloning)    33
2.3.7.    Giải trình tự gen    36
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    38
3.1.    Kết quả tách chiết mRNA tổng số và tổng hợp cDNA    38
3.2.    Kết quả xác định đột biến ở mức độ mRNA    40
3.2.1.    Kết quả nghiên cứu của bệnh nhân mã số 1    40
3.2.2.    Kết quả phân tích của bệnh nhân mã số 2    42
3.2.3.    Kết quả phân tích bệnh nhân mã số 4    43
3.2.4.    Kết quả nghiên cứu bệnh nhân mã số 7    44
3.2.5.    Kết quả phân tích đột biến của bệnh nhân mã số    10    45
3.2.6.    Kết quả điện di của nhóm các bệnh nhân không có đột biến xóa
đoạn    46
3.3.    Kết quả về tỷ lệ đột biến xóa đoạn và phân bố vị trí các exon bị xóa
đoạn trên gen Dystrophin    47
Chương 4: BÀN LUẬN    50
4.1.    Quy trình tách chiết RNA và tổng hợp phân tử cDNA    50
4.2.    Xác định đột biến mất đoạn gen Dystrophin    52
4.2.1.    Kết quả phân tích của bệnh nhân mang mã số 1    52
4.2.2.    Kết quả nghiên cứu của bệnh nhân mang mã số 2    55
4.2.3.    Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen của bệnh nhân mã số 4 .. 55
4.2.4.    Kết quả xác định mất đoạn gen của các bệnh nhân khác    56
4.3.    Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen Dystrophin của bệnh nhân DMD    56
4.4.    Vị trí các exon bị đột biến mất đoạn    59
KẾT LUẬN    62
TÀI LIỆU THAM KHẢO