nghiên cứu đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mrna trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenne

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular  Dystrophy  –  DMD)  là  một  bệnh  di truyền lặn liên kết với giới tính. Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen Dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 2400 Kb, mã hóa  14 – kb mRNA, bao gồm 79 exon. Protein mã hóa bởi gen này là Dystrophin, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng cơ. Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 ÷ 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500 trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã hội. Cho đến nay bản đồ đột biến gen Dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất, với hai vùng đột biến mất đoạn trọng điểm (hotspot region) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ 2 chiếm 25 – 30%, đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 10 – 15%. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân  tử.  Tuy  nhiên,  do  khó  khăn  tách  chiết mRNA tổng số từ máu tươi, những nghiên cứu này mới chỉ xác định được đột biến ở mức DNA. Do mới sử dụng 19 cặp mồi để khuyếch đại 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn nên kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỷ lệ thường gặp là 60%. Điều này chứng tỏ rằng khoảng 20% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn trên  bệnh nhân DMD được  nghiên cứu ở  Việt Nam.  Trong  khi  đó  nếu  chẩn  đoán  ở  mức  độ mRNA thì chỉ với 15 cặp mồi đã có thể khuyếch đại được toàn bộ chiều dài gen Dystrophin. Xác định đột biến ở mức độ mRNA có thể xác định được toàn bộ đột biến mất đoạn trên gen Dystro- phin ở bệnh nhân DMD. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu:
Xác định tỷ lệ mất đoạn từng exon và tỷ lệ phân bố vùng đột biến mất đoạn của gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA.

I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
Nhóm chứng: gồm 10 nam giới bình thường, được dùng như chứng dương bình thường để chạy PCR cùng với mẫu bệnh nhân.
Nhóm bệnh: gồm 10 bệnh nhân được chẩn đoán là loạn dưỡng cơ  Duchenne/Becker dựa vào các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình.
2.    Phương pháp nghiên cứu
Áp dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang.
    Quy trình lấy mẫu
Mỗi đối tượng được lấy 10 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA với hàm lượng 1,5 mg/ mL. Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
    Quy trình tách chiết RNA tổng  số  và tổng hợp cDNA
Quy trình tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA được tiến hành theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước đây bởi Tran et al và cộng sự [6].
    Phản ứng nested – PCR xác định đột biến
Nguyên lý phản ứng Nested – PCR:
Kỹ thuật này dùng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau (có nghĩa rằng cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất). Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR lần thứ 2. Phản ứng nested – PCR được ứng dụng sử dụng 15 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại toàn bộ chiều dài gen Dystrophin nhằm xác định đột biến ở mức độ mRNA.
Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, bệnh gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Dạng đột biến thường gặp nhất là đột biến mất đoạn. Chẩn đoán ở mức độ DNA sẽ mất nhiều thời gian và tiêu tốn hóa chất nên người ta thường chỉ xác định đột biến ở 2 vùng trọng điểm (5 tận và trung tâm) vì vậy bỏ sót đột biến gen ở 60 exon còn lại. Trong khi đó khi sử dụng kỹ thuật chẩn đoán ở mức độ mRNA thì có thể xác định nhanh và toàn diện đột biến xóa đoạn trên gen dystrophin. Mục tiêu: xác định tỷ lệ và phân bố vùng đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 10 bệnh nhân được chẩn đoán là loạn dưỡng cơ Duchenne dựa vào các triệu chứng lâm sàng điển hình và nồng độ CK tăng cao trong máu; RNA tổng số được tách chiết từ máu ngoại vi và tổng hợp cDNA; phản ứng nested PCR và đọc trình tự được sử dụng để phát hiện đột biến xóa đoạn. Kết quả: đột biến mất đoạn chiếm tỷ lệ 50%; phân bố vùng đột biến mất đoạn gen dystrophin chủ yếu ở vùng trọng điểm trong đó 40% ở vùng 5 tận và 40% ở vùng trung tâm. Đặc biệt là phát hiện được 20% đột biến nằm ở ngoài vùng trọng điểm. Kết luận: xác định đột biến gen ở mức độ mRNA không chỉ phát hiện được đột biến xóa đoạn ở 2 vùng trọng điểm mà còn giúp phát hiện nhanh, chính xác và toàn diện đột biến xóa đoạn gen dystrophin