Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ơ bệnh nhân hemophilia B

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ơ bệnh nhân hemophilia B.Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh. Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30.000 nam giới [3] [4]. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài.

Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.1-q27.2) do đó hemophilia B là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính. Nam giới bị bệnh sinh ra tất cả con gái là người mang gen bệnh. Phụ nữ mang gen bệnh có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho con trong mỗi lần sinh [5]. Chính vì vậy, phòng bệnh thông qua chẩn đoán người mang gen bệnh là cách tiếp cận hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Đây là nhiệm vụ, là mục tiêu chính của các chiến lược quản lý bệnh hemophilia B.
Hiện nay, trên thế giới có hai cách tiếp cận khác nhau để chẩn đoán người mang gen bệnh đó là phương pháp phân tích trực tiếp đột biến gây bệnh và phương pháp chẩn đoán gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9.
Phân tích trực tiếp là phương pháp đi tìm đột biến gen ở người bị bệnh, sau đó sử dụng chính đột biến ở người bệnh làm chỉ thị phân tử để chẩn đoán tình trạng mang gen và chẩn đoán trước sinh cho các thành viên nữ trong gia đình. Như vậy, trong phương pháp phân tích trực tiếp, đột biến gen ở người bệnh là cơ sở để xác định tình trạng mang gen bệnh. Phân tích gián tiếp còn được gọi là phân tích liên kết (linkage analysis). Phương pháp này không cần xác định cụ thể đột biến gây bệnh mà sử dụng các đa hình liên kết với gen F9 bệnh như những “chỉ điểm” để lần theo dấu vết gen2 bệnh, từ đó xác định người mang gen bệnh. Để áp dụng phân tích liên kết, ngoài việc đáp ứng các yêu cầu về mẫu bệnh phẩm, trong gia đình người bệnh cần xác định được người chắc chắn mang gen bệnh và dị hợp tử với ít nhất một đa hình trên gen F9. Việc tìm ra được một đa hình dị hợp tử ở người mang gen sẽ gặp nhiều khó khăn nếu như không có thông tin về tần suất dị hợp tử của các đa hình. Do đó, khảo sát để tìm ra các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao, đặc trưng cho quần thể đóng là bước quan trọng đầu tiên để có thể ứng dụng hiệu quả phương pháp phân tích liên kết [5] [6].
Trên thế giới, các nghiên cứu về biến đổi di truyền trên gen F9 đã được thực hiện từ rất lâu [7]. Đến nay, cơ sở dữ liệu đột biến trên thế giới đã ghi nhận trên 1000 đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia B và nhiều đa hình nucleotide trên gen F9 [4]. Nhiều quốc gia đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đột biến gen của bệnh nhân đồng thời xác định được các đa hình có giá trị trong chẩn đoán, do đó áp dụng linh hoạt được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen, hỗ trợ hiệu quả công tác kiểm soát và quản lý bệnh [8] [9] [10] [11] [12] [13].
Tại Việt Nam, chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B vẫn còn là một vấn đề nan giải. Theo ghi nhận của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW, mỗi năm có hàng trăm ca bệnh mới được phát hiện. Số liệu ước tính của trung tâm cho thấy có ~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý [14]. Chẩn đoán người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân và tư vấn sinh sản là biện pháp duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Tuy nhiên, hiện chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen
F9 ở người Việt Nam; nghiên cứu về đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B mặc dù đã được tiến hành trong một vài nghiên cứu nhưng cỡ mẫu chưa nhiều do đó dữ liệu về đột biến gen ở bệnh nhân còn rất thiếu. Do đó công tác chẩn đoán và quản lý người mang gen chưa hiệu quả dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh gia tăng. Chính vì vậy, với mong muốn tiếp cận để phối hợp được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và phân tích gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen bệnh hemophilia B tại Việt Nam, nghiên cứu sinh thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ơ bệnh nhân hemophilia B”.3
MỤC TIÊU
Mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B.
Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ
sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.
NỘI DUNG
1. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX trên máy giải trình tự gen thế
hệ mới (Next-Generation Sequencing).
– Thiết kế các cặp mồi gối đầu nhau để khuếch đại toàn bộ gen F9
– Xây dựng và tối ưu quy trình Long-range PCR khuếch đại gen F9
– Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS
– Khẳng định độ tin cậy của quy trình NGS bằng phương pháp Sanger
2. Giải trình tự gen F9 và lập bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B. Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
3. Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ khỏe mạnh. Xác định tần suất và tỷ lệ dị hợp tử các đa hình nucleotide trên gen F9.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn và tổng thể về đột biến trên toàn bộ gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất cả các vùng chức năng, các exon và intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen NGS.
2. Là công trình nghiên cứu tính đa hình nucleotid trên gen mã hóa yếu tố IX đầu tiên tại Việt Nam, thực hiện nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết