Nghiên cứu đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mrna

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, gen dystrophin bị đột biến nằm trên nhiễm sắc thể X. Dạng đột biến thường gặp nhất là đột biến xóa đoạn gen, chiếm 60-65%. Mục tiêu: xác định tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen dystrophin bằng phương pháp RT-PCR và tỷ lệ phân bố các exon bị xóa đoạn trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: RNA tổng số được tách chiết từ máu ngoại vi, tiến hành tổng hợp cDNA và sử dụng phản ứng Nested-PCR để phát hiện đột biến xoá đoạn gen. Kết quả: 52,4% bệnh nhân DMD bị đột biến xoá đoạn gen. Đột biến xảy ra chủ yếu ở vùng trung tâm của gen, chiếm 63,6%. Kết luận: Bằng phương pháp RT-PCR đã xác định đột biến xóa đoạn và tỷ lệ phân bố các exon bị xóa đoạn trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne như sau: Tỷ lệ bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn gen Dystrophin của 42 bệnh nhân là 52,4%. Phân bố vùng đột biến xóa đoạn trên gen Dystrophin của 22 bệnh nhân thứ tự như sau: Đột biến vùng exon 1 – 19 là 18,2%; Đột biến vùng exon 40 – 60 là 63,6%; Đột biến từ vùng tận 5’đến trung tâm là 9,1%; Xóa đoạn exon ngoài vùng hotspot là 9,1%.
I.    ĐẶT VẤN ĐỀ
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dytrophy – DMD) là bệnh lý di truyền lặn liên kết với NST giới tính X, thường gặp ở trẻ trai với tần suất mắc bệnh 1/3500. Bệnh gây nên do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, bao gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Đây là bệnh lý cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến, bệnh nhân mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết vào tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp. Cho đến nay bản đồ đột biến gen dystrophin đã được hoàn thiện và công bố, phổ biến nhất là đột biến xóa đoạn gen, chiếm 60 – 65%; đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp với tỷ lệ 25 – 30%; đột biến lặp đoạn chiếm 10-15%. Đột biến xóa đoạn thường xảy ra ở hai vùng trọng điểm (gọi là vùng hotspot): vùng trung tâm (từ exon 43 đến exon 60) và vùng tận cùng 5’ (từ exon 1 – 19) [3].
Ở Việt Nam, bệnh DMD đã được nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ và hoạt độ của enzym Creatine Kinase (CK) huyết thanh. Tuy nhiên, những kết quả này đều chỉ mang tính chất gợi ý, chưa có bằng chứng rõ ràng về tổn thương ở mức độ di truyền, do đó kết quả chưa có sức thuyết phục để thực hiện tư vấn về di truyền. Giai đoạn 1998 – 2003, có một số nghiên cứu ở mức độ di truyền nhưng hầu hết chỉ mang tính chất thăm dò trên số lượng ít bệnh nhân. Năm 2004, nhờ có sự hợp tác giữa Bệnh viện Nhi Trung Ương và Nhật Bản, một nghiên cứu xác định đột biến xóa đoạn trên 85 bệnh nhân DMD Việt Nam đã được thực hiện. Do chưa chuẩn hóa được quy trình tách chiết RNA tổng số từ máu tươi nên những bệnh nhân DMD Việt Nam chỉ được xác định đột biến xóa đoạn gen ở mức độ DNA và các nghiên cứu chỉ sử dụng 19 cặp mồi để khuyếch đại 19 exon (trong tổng số 79 exon của gen dystrophin) thuộc hai vùng hotspot mà chưa khuyếch đại được 60 exon còn lại. Các nghiên cứu chỉ phát hiện được 30 – 40% số bệnh nhân có đột biến xóa đoạn so với tỷ lệ thường gặp là 60 – 65%. Điều này chứng tỏ là khoảng gần 30% đột biến xảy ra nằm ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân DMD được nghiên cứu ở Việt Nam [1][2][7].
Như vậy, việc xác định được đột biến ở 60 exon còn lại là cần thiết. Tuy nhiên việc xác định được đột biến ở mức độ DNA với 60 exon còn lại đòi hỏi phải thiết kế thêm 60 cặp mồi tương ứng. Việc này chi phí rất tốn kém về cả mặt thời gian, kinh phí lẫn công sức. Trong khi đó nhờ phản ứng RT-PCR, phân tử cDNA (chứa 79 exon của gen dystrophin) được tổng hợp từ phân tử mRNA và chỉ cần sử dụng 15 cặp mồi chúng ta có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn gen dystrophin. Do vậy, việc xác định đột biến ở mức độ mRNA sẽ tiết kiệm được nhiều thời gian cũng như hoá chất so với mức độ DNA mà các nghiên cứu trước đã tiến hành.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: (1)Xác định tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen dystrophin bằng phương pháp RT-PCR và (2) Xác định phân bố các exon bị xóa đoạn trên bệnh nhân loạn dưỡng cơDuchenne.
II.    Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.    Đối tượng nghiên cứu
–    Nhóm bệnh: gồm 42 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD dựa vào các triệu chứng lâm sàng điển hình và enzym CK tăng cao, các bệnh nhân này chưa được tiến hành xét nghiệm phân tích gen dystrophin.
–     Nhóm chứng: gồm 20 nam giới bình thường, được dùng làm chứng dương chạy PCR cùng với mẫu bệnh nhân.
2.2.    Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.    Quy trình lấy mẫu: mỗi đối tượng được lấy 7ml máu tĩnh mạch có chống đông EDTA với hàm lượng 1,5mg/ml. Quy trình lấy mẫu được bảo đảm tuyệt đối vô trùng.
2.2.2.    Quy trình tách chiết mRNA tổng số: kỹ thuật tách chiết RNA được tiến hành theo quy trình chuẩn của Isogen. Đo nồng độ và độ tinh sạch của RNA tổng số, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt > 1,8 mới được sử dụng để tổng hợp cDNA.
2.2.3.    Phản ứng RT-PCR tổng hợp cDNA: sử dụng phương pháp MMLV-RT để tổng hợp cDNA với ba giai đoạn: biến tính RNA ở nhiệt độ 60°C, giai đoạn gắn mồi ở 24°C và giai đoạn tổng hợp phân tử cDNA. Chu trình nhiệt của giai đoạn tổng hợp cDNA như sau: 37°C trong 50 phút, 68°C trong 15 phút và bảo quản tạm thời ở 4°C.
2.2.4.    Phản ứng Nested-PCR để xác định đột biến
–     Nguyên lý phản ứng Nested-PCR: sử dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotit lồng vào nhau (trình tự của cặp mồi thứ 2 nằm bên trong trình tự của cặp mồi thứ nhất). Sản phẩm của PCR lần 1 sẽ được dùng làm khuôn cho PCR lần 2.
–    Tiến hành: phản ứng Nested-PCR được tiến hành với 15 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại toàn bộ chiều dài (chứa 79 exon) của gen Dystrophin, trong đó có 5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 là 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B và 10 cặp mồi còn lại sử dụng cho phản ứng PCR lần 2.
–     Thành phần của phản ứng Nested-PCR: mỗi phản ứng PCR có thể tích là 20p,l chứa các thành phần: 20ng cDNA, 50ng mỗi primer, 200^mol/L dNTPs, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2^L GeneAmp 10xBuffer.