Nghiên cứu gen Pres, gen x của virut viêm gan b trong mô, huyết thanh và một số dấu ấn huyết thanh ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

Nhiễm virut viêm gan B (HBV) gặp ở hầu hết các nước trên thế giới, và cũng là mối quan tâm chung của cả công đổng vì những ảnh hưởng về sức khoẻ, kinh tế, xã hôi do các biến chứng của nó gây ra. Nguy cơ lây nhiễm HBV trong công đổng rất cao, ngoài khả năng tổn tại của virut ở môi trường sống khá lâu, thì cứ 2 trong 3 người nhiễm HBV mạn tính đều không biết mình mang bênh, các chỉ số sinh hoá máu gần như bình thường ở giai đoạn đầu nhiễm bênh [40]. Ở các nước vùng Châu Á, thời gian nhiễm tiềm tàng có thể diễn biến trong 20- 30 năm [97] vì vây lây nhiễm HBV do truyền từ mẹ sang con và hoạt đông tình dục là đường lây chủ yếu. Trong suốt quá trình mang virut kéo dài, biến chứng thành viêm gan mạn tính, xơ gan, ung thư gan chiếm từ 15%- 40% số người nhiễm HBV mạn tính [40], [61], [135].

Từ khi Blumberg phát hiên và xác định ra HBV, cho tới nay đã hơn 40 năm, cùng với sự ra đời của vacxin đã đem lại hiệu quả cao trong phòng bênh, giảm đáng kể được tỷ lệ mang HBsAg mạn tính trong công đổng, đặc biệt ở các quốc gia thực hiện tốt chương trình tiêm chủng mở rông [25], [87], [108]. Vì vây, đã giảm đáng kể số ung thư gan nhất là ở trẻ em [51], [135], nhưng các biến chứng do nhiễm HBV trong công đổng vẫn còn nhiều và ung thư gan vẫn là mối lo ngại của nhiều nước trên thế giới. Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) có nhiễm HBV chiếm trên 70% các trường hợp [4], [14], [20], [100], [135] và ung thư gan gặp ở nam giới nhiều hơn so với nữ giới ở hầu hết các châu lục [12], [58], [96], [99], [135], [149].

Ở Việt Nam, có 8,4 triệu người mang HBV mạn tính vào năm 2005, tuy nhiên con số này có thể duy trì hoặc giảm bớt còn khoảng 8 triệu vào năm 2025 do thực hiện tốt chương trình tiêm chủng [109]. Ung thư gan sau quá trình nhiễm HBV là môt biến chứng cuối cùng và cũng thường gặp ở Việt Nam, dự báo năm 2025 sẽ có khoảng 25.000 trường hợp mắc HCC [109].

Cơ chế ung thư gan do HBV đã được nhiều tác giả trên thế giới chứng minh bằng các nghiên cứu từ thực nghiêm trong phòng thí nghiêm [TS], [94], [133], và trên đông vât [65], [T2], [TT], [S1]. Có hai vùng gen được nhiều nghiên cứu đề câp có liên quan tới cơ chế gây ung thư gan là vùng gen X và vùng gen PreS2 (thuộc gen PreS) của HBV. Gen X có chức năng là V.oncogen, tham gia vào hầu hết các cơ chế gây ung thư gan: tăng phân bào, ức chế apoptosis, gây đôt biến nhiêm sắc thể của tế bào chủ…[T3], [TS], [SO], [139], [143], [15O]. Vùng gen PreS2 ảnh hưởng tới mã hoá MHBs cũng thấy có liên quan tới cơ chế tăng phân bào do kích thích liên tục tín hiêu c-raf-1/Erk2 [65].

Môt số nghiên cứu cho thấy HBV có tính đôt biến cao [3O], [35], [46], [56], [64], [ST], đôt biến tích luỹ mỗi năm từ 1,5-T,9/ 1OO.OOO vị trí/ năm [35], sự đôt biến của HBV biểu hiên ở mô gan và huyết thanh giống nhau hay khác nhau cũng chưa rõ ràng [43], [111], [142]. Nghiên cứu đạc điểm của vùng gen X, gen PreS ở mô và huyết thanh nhằm tìm hiểu sự thay đổi của HBV ở bệnh nhân nhiêm HBV mạn tính, bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan ở Việt Nam cho tới nay chưa được tác giả nào đề cập đến. Vi vây nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu:

1. Nghiên cứu tỷ lê ADN- HBV(+), trình tự nucleotid vùng gen PreS, X trong

huyết thanh và mo ung thư ở bênh nhân ung thư biểu mo tế bào gan.

2. Phát hiên một số đột biến vùng gen PreS, X ở bênh nhân ung thư biểu

mo tế bào gan.

S. Xác định tỷ lê phân bố giữa kiểu gen của HBV với một số dấu ấn huyết thanh ở bênh nhân ung thư biểu mo tế bào gan.

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIÊU 3

1.1. Tình hình nhiễm HBV và các biến chứng thường gặp

1.1.1. Trên thế giới 3

1.1.2. Việt Nam 4

1.1.3. Diễn biến quá trình nhiễm HBV mạn tính 5

1.2. Cấu trúc HBV và chức năng các kháng nguyên:

1.2.1. Cấu trúc hình thái HBV 6

1.2.2. Cấu trúc bô gen của HBV và các protein được mã hoá 7

1.2.3. Phân loại kiểu gen của HBV 10

1.2.4. Chức năng các kháng nguyên của HBV 13

1.2.5. Quá trình xâm nhập và sao chép của HBV 14

1.3. Diễn biến một số dấu ấn trong huyết thanh liên quan tới nhiễm HBV

1.3.1. Diễn biến các dấu ấn trong viêm gan B cấp 16

1.3.2. Diễn biến các dấu ấn trong viêm gan B mạn 17

1.3.3. Môt số định nghĩa cho những đối tượng nhiễm HBV 18

1.3.4. Cơ chế tổn thương mô bệnh học ở gan khi nhiễm HBV 19

1.4. Cơ chế ung thư gan liên quan tới nhiễm HBV 21

1.4.1. Môt số tác nhân gây ung thư 21

1.4.2. Cơ chế ung thư biểu mô tế bào gan liên quan tới nhiễm HBV 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1. Đối tượng nghiên cứu 33

2.2. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu 34

2.3. Các biến số nghiên cứu 49

2.4. Phân tích kết quả 49

2.5. Hạn chế’ sai số 52

2.6. Đạo đức trong nghiên cứu 53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 54

3.1. Phân bố tuổi, giới, các dấu ấn huyết thanh của nhóm HCC

3.1.1 .Phân bố tuổi 54

3.1.2. Phân bố giới 54

3.1.3. Kết quả các dấu ấn trong huyết thanh 54

3.1.4. Biểu hiên dấu ấn HBeAg và antiHBe của HBV theo tuổi: 55

3.1.5. Kết quả một số chỉ tiêu của nhóm HCC và nhóm chứng 56

3.2. Kết quả nghiên cứu gen PreS, gen X của HBV

ở mô và huyết thanh: 57

3.2.1. Kết quả Nested-PCR, PCR vùng gen PreS, X 57

3.2.2. Kết quả phân tích trình tự gen của gen PreS, gen X 59

3.3. Kết quả kiểu gen, một số đột biến của HBV nhóm HCC và nhóm chứng:

3.3.1: Kết quả cây phân bố kiểu gen giữa nhóm HCC và nhóm chứng 78

3.3.2. Tỷ lê kiểu gen của HBV nhóm HCC và nhóm chứng 80

3.3.3. Kết quả so sánh đặc điểm Nu vùng gen Surface promoter 2 80

3.3.4.So sánh đặc điểm aa vùng gen PreS nhóm HCC và nhóm chứng 82

3.3.5. Kết quả đánh giá vùng gen tăng cường EnhlI 84

3.3.6. Kết quả xác định đột biến Precore G1896A 87

3.4. Kết quả so sánh kiểu gen với một số dấu ấn trong huyết thanh:

3.4.1. Kết quả so sánh kiểu gen với HBeAg và antiHBe: 88

3.4.2. Kết quả so sánh kiểu gen với AFP, AST, ALT 89

3.4.3. Kết quả so sánh kiểu gen với lứa tuổi 90

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 91

4.1. Tuổi, giới, một số dấu ấn trong huyết thanh bênh nhân HCC 91

4.1.1. Tuổi của nhóm bênh nhân HCC 91

4.1.2. Giới của nhóm HCC 92

4.1.3. Đặc điểm các dấu ấn trong huyết thanh nhóm HCC 92

4.1.4. Đánh giá so sánh một số chỉ tiêu của nhóm HCC và nhóm chứng 96

4.2. So sánh trình tự gen PreS, gen X trong mô và huyết thanh:

4.2.1. Đánh giá thay đổi về trình tự Nu giữa mô và huyết thanh gen PreS 97

4.2.2. Các dạng đột biến vùng gen X với bênh ung thư gan ở Việt Nam 99

4.3. Đánh giá một số đột biến điểm vùng gen X thường gặp

có liên quan tới HCC trên lâm sàng 104

4.3.1. Đột biến BCP (A1762T/G1764A) 104

4.3.2. Đột biến tiền lõi: G1896A 105

4.4. Kiểu gen của HBV và một số yếu tố nguy cơ

4.4.1. Phân bố kiểu gen ở nhóm HCC và nhóm chứng 107

4.4.2. So sánh với một số yếu tố nguy cơ có liên quan 108

4.5. Đánh giá kết quả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu

4.5.1. Đánh giá kết quả Nested- PCR 110

4.5.2. Đánh giá kết quả giải trình tự gen 112

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 116

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 117

TÀI LIÊU THAM KHẢO 118

PHỤ LỤC