Nghiên cứu kiểu gen (genotype) của virút viêm gan B trên bệnh nhân ung thư gan bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

– Địa điểm lấy mẫu là Bệnh viện 108 và Bệnh viện Việt Đức.

– Thu thập các mẫu bệnh phẩm máu và mô ung thư gan.

– Làm các xét nghiệm miễn dịch từ huyết thanh để xác định các dấu ấn của virut viêm gan B: HBsAg, anti HBs, HBeAg, anti HBe, antiHBc.

– Định lượng dấu ấn ung thư gan : AFP

– Đánh giá chức năng gan: men SGOT, SGPT.

– Đọc, thẩm định kết quả giải phẫu bệnh tại Bộ môn Giải phẫu bệnh- ĐHYHN

– T ách ADN từ huyết thanh và ADN từ mô ung thư gan

– Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại 4 đoạn gen đặc trưng cho 4 khung đọc mở của virut viêm gan B, tương ứng với các vùng sản xuất các dấu ấn có trong huyết thanh của bệnh nhân. Lựa chọn các cặp mồi có trình tự và vị trí khuếch đại như sau:

Surfacegene:

PCR1

Forward: 5′- ATCAGGATTCCTAGGACCC- 3′

Reverse: 5 ‘-AGGACAACGGGCAACATAC-3’

PCR2

Forward: 5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3′

Reverse: 5 ‘-GAACCAACAAGAAGATGAGGC-3’

Polymerase gene:

PCR1

Forward:5′-CCATACTGCGGAACTCCTAG-3’ 

Reverse: 5 ‘-GAAGTATGCCTCAAGGTCGG-3’ 1692-1711

PCR2

Forward: 5′-GACAACTCTGTTGTTCTCTC-3′ 1335-1354

Reverse: 5 ‘-CGAAGTGCACACGGTCCGGC- 3’ 1571-1590

Coregene:

PCR1

Forward:5′-TGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCC-3′ 1938-1961

Reverse:5′-CGGAGGTGTTGATAAGATAGGGG-3′ 2313-2334

PCR2

Forward:5′-GTATCGGGAAGCCTTAAAGTCTCC-3′ 2013-2036

Reverse:5 ‘-TAAGCGGGAGGAGTGCGAATCC- 3’ 2276-2297

Core promotor gene PCR1

Forward:5′-ATGGCTGCTCGGGTGTGC-3′ 1376-1395

Reverse:5 ‘-AGATGATTAGGCAGAGGTG- 3’ 1828-1846

PCR2

Forward:5′-TGTGCACTTCGCTTCACCTCT – 3′ 1580-1600

Reverse:5 ‘-TGAACAGACCAATTTATGCC- 3’ 1788-1807

– Trong giai đoạn đầu chúng tôi chỉ lựa chọn để khuếch đại cặp mồi vòng ngoài, sau đó sẽ tiếp tục thực hiện khuếch đại vòng trong để cho sản phẩm tinh khiết hơn cho thực hiện giải trình tự gen. Tuy nhiên, với cặp mồi ngoài vùng gen corepromotor không thực hiện được phản ứng nên chúng tôi đã chỉ sử dụng cặp mồi trong.

Kết quả nghiên cứu:

– Việt nam cũng như các nước vùng châu Á có tần xuất lưu hành viêm gan B cao. Tỷ lệ người mang virut viêm gan B trong cộng đồng từ 10-20 %. Để chẩn đoán nhiễm viêm gan B hiện nay chúng ta chủ yếu là xác định kháng nguyên bề mặt của virut trong máu (HBsAg). Nhưng hiện nay, nhờ phát triển và ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán, một số

tác giả đã cho thấy virut vẫn có thể tồn tại trên một số người đã phơi nhiễm viêm gan B cho dù đã xuất hiện kháng thể anti HBs và HBsAg âm tính(-) trong huyết thanh. Do vậy, năm 2000 NIH (National Institutes of health) đã thống nhất cho chẩn đoán bệnh nguyên của virut viêm gan B ở dạng biến thể, không xác định được HBsAg trong huyết thanh nhưng tồn tại các dấu ấn khác của virut viêm gan B, hoặc có ADN của virut khi khếch đại bằng phản ứng PCR.

– Trong các mẫu bệnh nhân ung thư đã thu thập được, chúng tôi đánh giá đầy đủ các dấu ấn của virut trong huyết thanh để xác định tỷ lệ phơi nhiễm viêm gan B trên bệnh nhân ung thư gan tại Việt Nam, đặc biệt để đánh giá đúng bệnh nguyên . Kết quả cho thấy:

+Trong số 38 bệnh nhân ung thư gan, có 7/38 bệnh nhân HBsAg(-) thì 3/7 bệnh nhân có tồn tại kháng thể anti HBs, anti HBc. Điều này chứng tỏ bệnh nhân vẫn có thể phát triển ung thư sau phơi nhiễm viêm gan B, virut vẫn tồn tại trong mô gan nhưng có thể ở dạng đột biến, không sản xuất HBsAg hoặc sản xuất với số lượng rất ít không thể phát hiện được trong huyết thanh bằng các kỹ thuật thông thường.

– Hiện nay có rất nhiều phương pháp để tách ADN từ tổ chức. Mỗi tổ chức mô khác nhau đòi hỏi có những chú ý khác nhau trong quá trình tách chiết. Đặc biệt, các mẫu mô gan thu thập được của chúng tôi cũng khác nhau giữa hai phương pháp chọc hút tế bào và mô cắt sau phẫu thuật. Do đó, cần phải thực hiện hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN từ huyết thanh và mô ung thư gan (mô cắt sau phẫu thuật vá tổ chức dochọc hút). Lựa chọn số lượng mẫu tách chiết ADN phù hợp cho cả mẫu mô thu được không nhiều bằng chọc hút tế bào. Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng PROMEGA- Mỹ, tuân thủ theo 12 bước với số lượng mẫu mô từ 10-20mg. Các sản phẩm ADN thu được chúng tôi kiểm tra độ tinh khiết và tính nồng độ ADN trên máy quang phổ với OD260/280 để phục vụ cho phản ứng PCR.