Nghiên cứu kiểu gen TP53 và MDM2 trong ung thư tế bào gan nguyên phát
Luận văn Nghiên cứu kiểu gen TP53 và MDM2 trong ung thư tế bào gan nguyên phát. Ung thư tế bào gan nguyên phát (hepatocellular carcinoma-HCC, UTTBGNP) là bệnh lý ác tính hay gặp hàng đầu trên thế giới. Theo tổ chức Y Tế thế giới, hàng năm có hơn nửa triệu trường hợp mắc mới trên toàn cầu. Bệnh có tỷ lệ tử vong cao, đứng thứ hai trong các nguyên nhân tử vong do ung thư ở nam giới, chỉ sau ung thư phổi. Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ công bố, năm 2012 thế giới có khoảng 745.500 người chết vì ung thư gan [1],[2]. Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng dịch tễ có tỷ lệ viêm gan virus cao nên có số người mắc UTTBGNP tương đối lớn. Ước tính trung bình mỗi năm cả nước có trên 10.000 ca UTTBGNP mới phát hiện, tỷ lệ này thuộc hàng cao nhất thế giới [3],[4],[5].
Các yếu tố nguy cơ gây UTTBGNP từ lâu đã được biết đến như viêm gan virus B, C, nghiện rượu, aflatoxin B1, tình trạng xơ gan, gan nhiễm mỡ không do rượu… [6]. Gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của chuyên ngành sinh học phân tử, vai trò của yếu tố gen-di truyền đã được đề cập. Một trong những hướng nghiên cứu là tìm kiếm các kiểu gen có nguy cơ cao phát sinh ung thư gan từ các gen tiềm năng. Các kiểu gen nguy cơ, sau đó sẽ phát triển thành các phương tiện sàng lọc sớm và tư vấn cho cộng đồng, để phòng tránh UTTBGNP. Hầu hết các nhóm gen tiềm năng, liên quan với ung thư gan đã được nghiên cứu, chúng bao gồm gen mã hoá các enzym chuyển hoá rượu (ADH, ALDH), gen mã hoá các enzym chuyển hoá hợp chất xenobiotic (CYP…), các gen P-catenin trong sự tăng trưởng tế bào, gen mã hoá các cytokin gây viêm (IL, TNF-a…) các gen ức chế khối u (TP53, MDM2…) [7],[8],[9].
TP53 là một trong những gen được nghiên cứu nhiều nhất, và có tần số đột biến lớn nhất trong ung thư gan [9]. Gen TP53 là nhạc trưởng trong con đường tín hiệu p53, một cơ chế chống ung thư quan trọng của con người. Khi các yếu tố có hại làm tổn thương bộ gen, TP53 sẽ được hoạt hóa gây dừng chu kỳ phân bào cho đến khi DNA được sửa chữa hoặc gây chết tế bào theo chương trình nếu DNA tổn thương không sửa chữa được. Vì vậy, TP53 được xem như trạm gác của bộ gen tế bào (guardian genome) [10],[11],[12],[13]. Tuy nhiên sự biểu hiện của TP53 lại chịu sự kiểm soát của MDM2. Một gen điều hoà trong con đường tín hiệu p53. MDM2 kiểm soát TP53 thông qua quá trình giáng hóa protein TP53. Ngược lại, TP53 hoạt hóa lại thúc đẩy quá trình phiên mã MDM2. Sự điều hòa ngược của hai gen này đảm bảo cho sự ổn định bộ gen tế bào [14],[15]. Nếu một trong hai gen bị biến đổi, sẽ dẫn đến sự mất kiểm soát quá trình phân chia tế bào, tạo cơ hội để các dòng tế bào ung thư xuất hiện và phát triển.
Hiện tượng thay thế các nucleotid đơn của TP53 và MDM2 tạo ra các kiểu gen khác nhau trong cộng đồng [11]. Sự phân bố các kiểu gen này liên quan đến bệnh sinh của nhiều loại hình ung thư, trong đó có ung thư tế bào gan nguyên phát [16],[17],[18],[19],[20]. Việc xác định khả năng mắc bệnh của các kiểu gen TP53 và MDM2 rất có giá trị trong sàng lọc sớm, phòng tránh, theo dõi, ngăn ngừa sự hình thành và phát triển khối u gan. Đây được xem như một hướng tiếp cận mới đầy triển vọng, góp phần làm giảm tỷ lệ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kiểu gen TP53 và MDM2 trong ung thư tế bào gan nguyên phát” với các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:
1.Xác định tỷ lệ phân bố kiểu gen TP53 ở bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và nhóm chứng.
2.Xác định tỷ lệ phân bố kiểu gen MDM2 ở bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và nhóm chứng.
3.Đánh giá mối tương quan giữa các kiểu gen TP53, MDM2 và một số yếu tố nguy cơ gây ung thư tế bào gan nguyên phát.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ1
Chương 1: TỔNG QUAN3
1.1.Ung thư tế bào gan nguyên phát3
1.1.1.Dịch tễ học3
1.1.2.Các yếu tố nguy cơ5
1.1.3.Bệnh học phân tử ung thư tế bàogan nguyên phát12
1.2.Gen TP53 và MDM2 28
1.2.1.Gen áp chế ung thư TP5328
1.2.2.Gen sinh ung thư MDM234
1.2.3.Biến đổi của gen TP53 và MDM2 trong ung thư37
1.3.Đa hình kiểu gen TP53 và MDM2liên quan ung thư tế bào gan
nguyên phát39
1.3.1.Hiện tượng đa hình nucleotid đơn39
1.3.2.Tính đa hình của gen TP5341
1.3.3.Tính đa hình thái của gen MDM244
1.3.4.Tính đa hình thái của gen TP53 và MDM2 trong ung thư tế bào
gan nguyên phát45
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU51
2.1.Đối tượng nghiên cứu51
2.1.1.Nhóm bệnh51
2.1.2.Nhóm chứng51
2.1.3.Các đa hình kiểu gen được phân tích52
2.2.Phương pháp nghiên cứu53
2.2.1.Thiết kế nghiên cứu53
2.2.2.Cỡ mẫu53
2.2.3.Dụng cụ, trang thiết bị54
2.2.4.Hóa chất dùng trong nghiên cứu54
2.2.5.Cách thức tiến hành nghiên cứu55
2.3.Thời gian và địa điểm nghiên cứu64
2.4.Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài64
2.5.Kinh phí thực hiện đề tài64
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU65
3.1.Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu65
3.2.Kết quả phân tích đa hình kiểu gen TP5367
3.2.1.Thêm đoạn 16 base pairs tại intron 3 67
3.2.2.Đa hình kiểu gen tại SNP D21D70
3.2.3.Đa hình kiểu gen của SNP P34P, P36P và P47S71
3.2.4.Kết quả phân tích kiểu gen của SNP V217M73
3.2.5.Kết quả phân tích kiểu gen của SNP G360A75
3.2.6.Kết quả phân tích kiểu gen của SNP R72P77
3.3.Kết quả phân tích đa hình kiểu gen MDM283
3.4.Tương quan giữa đa hình kiểu gen TP53, MDM2 và một số yếu tố
nguy cơ UTTBGNP90
3.4.1.Sự kết hợp các kiểu gen của TP53 với MDM290
3.4.2.Kiểu gen TP53-R72P và MDM2-309T>G với nhiễm HBV91
3.4.3.Tương quan giữa các kiểu gen TP53 R72P và MDM2 309T>G
với một số yếu tố nguy cơ UTTBGNP khác93
Chương 4: BÀN LUẬN100
4.1.Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu100
4.2.Đa hình kiểu gen TP53106
4.3.Đa hình kiểu gen MDM2117
4.4.Tương quan giữa đa hình kiểu gen TP53, MDM2 và các yếu tố nguy
cơ gây ung thư tế gan nguyên phát120
4.4.1.Kết hợp kiểu gen của TP53 và MDM2121
4.4.2.Đa hình kiểu gen TP53, MDM2 và HBV124
4.4.3.Đa hình kiểu gen và một số yếu tố nguy cơ UTTBGNP khác.. 127
KẾT LUẬN131
KIẾN NGHỊ, ĐỀ XUẤT133
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Một số SNP trên gen MDM245
Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các SNP57
Đặc điểm tuổi của nhóm đối tượng nghiên cứu65
Đặc điểm giới tính nhóm đối tượng nghiên cứu66
Một số yếu tố nguy cơ ghi nhận ở bệnh nhân UTTBGNP67
Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của đa hình dup16 gen TP5368
Đa hình kiểu gen dup16 liên quan đến UTTBGNP69
Bảng tổng hợp kiểu gen của các SNP tại codon 21, 34, 36, 47,
72, 217, 360 gen TP5377
Tỷ lệ các kiểu gen của SNP R72P ở nhóm đối tượng nghiên cứu80 Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP TP53-R72P giữa nhóm
bệnh và chứng80
Các kiểu gen của SNP TP53-R72P với khả năng mắc ung thư tế
bào gan nguyên phát82
Độ tuổi trung bình của bệnh nhân UTTBGNP mang các kiểu
gen TP53-R72P83
Tỷ lệ các kiểu gen MDM2 309T>G trong nhóm đối tượng
nghiên cứu86
Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP MDM2-309T>G giữa nhóm
bệnh và chứng87
Đa hình kiểu gen MDM2-SNP309 và nguy cơ mắc UTTBGNP 88 Độ tuổi trung bình của bệnh nhân UTTBGNP mang kiểu các
kiểu gen của SNP 309T>G89
Kết hợp kiểu gen TP53 R72P + MDM2 309T>G và nguy cơ
mắc UTTBGNP90
So sánh nguy cơ mắc UTTBGNP của các kiểu gen và HBV91
Bảng 3.17. Kiểu gen TP53, MDM2 và nhiễm HBV trong khả năng mắc
UTTBGNP92
Bảng 3.18. So sánh nguy cơ mắc UTTBGNP của các kiểu gen và độ tuổi >4093 Bảng 3.19. Tỷ lệ phân bố kiểu gen SNP R72P gen TP53 và 309T>G gen
MDM2 theo giới trong nhóm bệnh nhân UTTBGNP94
Bảng 3.20. Tỷ lệ phân bố kiểu gen SNP R72P và MDM2 309T>G giữa bệnh
nhân UTTBGNP có và không có xơ gan95
Bảng 3.21. Kiểu gen TP53 R72P và MDM2 309T>G và nồng độ AFP96
Bảng 3.22. So sánh các kiểu gen và nhiễm HCV97
Bảng 3.23. So sánh nguy cơ mắc UTTBGNP của các kiểu gen và nghiện rượu97 Bảng 3.24. Tỷ lệ phân bố kiểu gen SNP R72P và MDM2 309T>G giữa bệnh
nhân UTTBGNP có và không có nghiện rượu98
Bảng 3.25. So sánh nguy cơ mắc UTTBGNP của các kiểu gen TP53, MDM2 và các yếu tố nguy cơ99
Hình 1.1.Phân bố tỷ lệ UTTBGNP trên thế giới3
Hình 1.2.Cơ chế phân tử của ung thư tế bào gan nguyên phát16
Hình 1.3. Một số điểm kiểm tra chu kỳ tế bào và điểm kiểm tra chết theo chương trình, thường bị mất trong ung thư tế bào gan
nguyên phát21
Hình 1.4.Oncogene thường gặp nhất trong ung thư tế bào gan nguyên phát26
Hình 1.5.Cấu trúc phân tử gen TP5 329
Hình 1.6.Cấu trúc phân tử protein p5330
Hình 1.7.Cơ chế dừng chu kỳ tế bào của p53 qua trung gian p2131
Hình 1.8.Các con đường gây apoptosis của p5333
Hình 1.9.Cấu trúc phân tử MDM235
Hình 1.10.Vai trò điều hoà p53 của MDM236
Hình 1.11. Mô phỏng hiện tượng đa hình nucleotid đơn40
Hình 1.12.Các SNPs trên các vùng mã hóa và không mã hóa của TP5343
Hình 2.1.Mô hình phân tích hình ảnh điệndi dup 16 của gen TP5356
Hình 2.2.Mô tả hình ảnh điện di sản phẩm cắt giới hạn của R72P59
Hình 2.3. Mô tả hình ảnh điện di sản phẩm cắt giới hạn MDM2 309 T>G …. 60
Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu63
Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ giới tính của nhóm nghiên cứu66
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của đoạn gen intron 3 có
chứa đa hình dup 16 của gen TP5368
Hình 3.3. Hình ảnh PCR khuếch đại exon 2 có chứa vùng SNP D21D
của gen TP5370
Hình 3.4. Hình ảnh giải trình tự các kiểu gen của SNP D21D gen TP53 …. 70 Hình 3.5. Hình ảnh PCR khuếch đại exon 4 của gen TP5371
Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP P34P
gen TP5372
Hình 3.7. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP P36P
gen TP5372
Hình 3.8. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP P47S
gen TP5373
Hình 3.9. Hình ảnh PCR khuếch đại exon 6 chứa vùng SNP V217M
của gen TP5374
Hình 3.10. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP V217M
gen TP5374
Hình 3.11. Hình ảnh PCR khuếch đại exon 10 chứa vùng SNP G360A
của gen TP5375
Hình 3.12. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen của SNP G360A
gen TP5376
Hình 3.13. Hình ảnh PCR khuếch đại đoạn gen mang SNP R72P của
gen TP5378
Hình 3.14. Sản phẩm cắt đoạn gen mang SNP R72P bằng enzym BstU78
Hình 3.15. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu genSNP R72P79
Hình 3.16. Biểu đồ phân bố tỷ lệ kiểu gen của SNP R72P ở nhóm bệnh
nhân ung thư gan và nhóm chứng81
Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa SNP
309T>G của gen MDM284
Hình 3.18. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzym của SNP 309T>G
gen MDM284
Hình 3.19. Hình ảnh giải trình tự đại diện các kiểu gen SNP 309T>G của
gen MDM285
Hình 3.20. Biểu đồ phân bố kiểu gen của MDM2309T>G87
Hình 4.1. Virus và gen TP53, MDM2 trong con đường tín hiệu p53126
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất