Nghiên cứu kiểu hình, kiểu gen alpha-1-antitrypsin ở trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân tại bệnh viện Nhi trung ương

by

Nghiên cứu kiểu hình, kiểu gen alpha-1-antitrypsin ở trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân tại bệnh viện Nhi trung ương

Luận án Nghiên cứu kiểu hình, kiểu gen alpha-1-antitrypsin ở trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân tại bệnh viện Nhi trung ương.Những tiến bộ không ngừng của khoa học kỹ thuật đã giúp cho các nghiên cứu ngày càng có cơ hội đi sâu tìm hiểu về các protein chức năng và mối liên quan giữa đột biến làm thay đổi trình tự gen qui định sản xuất các protein này với các bệnh lý của cơ thể. Alpha-1-antitrypsin (A1AT) là một glycoprotein có khả năng ức chế nhiều loại protease khác nhau trong đó điển hình là neutrophil elastase (NE). Vì vậy A1AT có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng của hệ thống protease – protease inhibitor trong cơ thể, tham gia kiểm soát nhiều quá trình sinh học như đáp ứng viêm, điều hòa miễn dịch, quá trình đông máu, tiêu sợi huyết, hoạt hóa bổ thể…[16]. Càng đi sâu nghiên cứu, các nhà khoa học càng phát hiện thấy protein A1AT còn nhiều khả năng khác. A1AT có khả năng chống viêm và điều hòa miễn dịch, gắn với các protein được bài tiết bởi các Escherichia coli gây bệnh đường ruột là EspB và EspD và làm mất tác dụng phá hủy hồng cầu của chúng…[82],[95]. Đặc biệt, A1AT có thể ức chế caspase-3, nhờ đó có thể ức chế quá trình apoptosis của tế bào tại nhiều cơ quan trong cơ thể như phổi, gan, thận… [93].

Phân tử protein A1AT được mã hóa bởi gen SERPINA1 nằm ở cánh dài nhiễm sắc thể 14 (14q32.1) [81]. Đột biến làm thay đổi trình tự gen SERPINA1 tạo ra khoảng hơn 100 biến thể A1AT khác nhau, nhiều loại trong số đó có khả năng gây ra các tổn thương bệnh lý. Biến thể PI-M là biến thể bình thường gặp phổ biến nhất, chiếm khoảng 95% cá thể trong quần thể. Các biến thể bất thường có khả năng gây bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, chủng tộc và vùng miền khác nhau trên toàn thế giới, trong số đó PI-Z và PI-S được nói đến nhiều nhất [37].

Từ những số liệu nghiên cứu về dịch tễ, các nhà khoa học đã ước tính có khoảng 117 triệu người trên thế giới mang đột biến dị hợp tử PI-MZ và PI-MS; khoảng

3,4 triệu người mang đột biến đồng hợp tử PI-ZZ, PI-SS và PI-SZ gây thiếu A1AT mức độ nặng trong máu [15]. Sự phân bố của các biến thể A1AT có sự khác biệt theo chủng tộc và vùng địa lý. Biến thể bất thường gây bệnh PI-Z và PI-S hay gặp ở người da trắng vùng Bắc Âu với tần suất lần lượt là 1% đến 3% và 2% đến 3%, ít gặp hơn ở những chủng tộc khác [37]. Trong khi đó ở người phương Đông lại gặp những biến thể bất thường gây bệnh khác như Pittsburgh, Siiyama, Mnichinan, QOhongkong, QOclayton… [51],[85],[109],[65].

Biến thể bất thường gây thiếu A1AT trong máu được Laurell và Eriksson mô tả lần đầu tiên ở bệnh nhân bị khí phế thũng vào năm 1963. Sau đó bệnh cảnh xơ gan ở trẻ nhỏ do A1AT bất thường được Sharp và cộng sự ghi nhận năm 1969 bắt đầu làm cho các nhà khoa học thực sự quan tâm đến protein này. Một loạt các nghiên cứu tiếp theo cho thấy biến thể A1AT bất thường có thể gây ra nhiều tổn thương khác như viêm hoại tử mô mỡ dưới da, viêm mạch hệ thống, viêm thận, rối loạn đông máu… do hậu quả của sự mất cân bằng của hệ thống protease – protease inhibitor [8]. Về mức độ xuất hiện thì đột biến gen gây thiếu A1AT được đánh giá là một trong số những bệnh di truyền hay gặp trên thế giới. Về điều trị các bệnh lý do thiếu A1AT cũng đã có nhiều tiến bộ, có thể bổ sung A1AT cho cơ thể bằng đường tiêm tĩnh mạch hoặc khí dung hoặc ghép tạng khi cần. Biến thể đột biến A1AT nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ có thể ngăn ngừa được sự phát sinh bệnh phổi hoặc tiến triển của xơ gan, cải thiện được chất lượng sống, giảm tàn phế và tử vong cho bệnh nhân [35],[61]. Mặc dù vậy, cho đến nay các nhà khoa học thấy rằng việc chẩn đoán rối loạn di truyền này vẫn thường bị chậm trễ, thậm chí bị bỏ sót không được phát hiện.

Tại Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu về A1AT [2],[1],[4]. Chưa có nghiên cứu nào về kiểu hình, kiểu gen của các biến thể A1AT ở người bình thường cũng như ở người bị các bệnh về gan và phổi. Hàng năm, có nhiều trẻ bị các bệnh lý về gan nhập viện không xác định được nguyên nhân (chiếm 64,86% trường hợp viêm gan cấp, 54,22% trường hợp xơ gan, 30,73% trường hợp viêm gan mạn ở bệnh viện Nhi trung ương) nên việc điều trị gặp nhiều hạn chế [3]. Các biến thể A1AT ở nhóm có nhiều nguy cơ là những trẻ bị bệnh về gan mật chưa rõ nguyên nhân có đặc điểm gì là một câu hỏi cần được giải đáp. Xuất phát từ những thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu kiểu hình, kiểu gen alpha-1- antitrypsin ở trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân tại bệnh viện Nhi trung ương” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1. Xác định tỷ lệ thiếu hụt A1AT trong máu trẻ bị bệnh về gan.

2. Xác định kiểu hình, kiểu gen của các biến thể A1AT ở trẻ bị bệnh về gan.

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 4

1.1 Những hiểu hiết về protein A1AT 4

1.1.1 Danh pháp và lịch sử phát hiện A1AT 4

1.1.2 Vai trò, chức năng của A1AT 5

1.1.3 Cấu trúc của phân tử A1AT 7

1.1.4 Tổng hợp protein A1AT 9

1.2 Các biến thể của protein A1AT và những bệnh lý liên quan 12

1.2.1 Cơ chế tạo ra các biến thể A1AT 12

1.2.2 Cách gọi tên 13

1.2.3 Phân loại 14

1.2.4 Kiểu di truyền 16

1.2.5 Cơ chế sinh bệnh do các biến thể A1AT bất thường 18

1.2.6 Biểu hiện lâm sàng do các biến thể A1AT bất thường 23

1.2.7 Phát hiện biến thể A1AT bất thường ở nhóm cá thể có nguy cơ 26

1.3 Các kỹ thuật phát hiện biến thể A1AT 28

1.3.1 Định lượng nồng độ A1AT trong huyết thanh 28

1.3.2 Điện di xác định kiểu hình protein A1AT 29

1.3.3 Kỹ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen A1AT 32

1.4 Tình hình nghiên cứu về A1AT tại Việt Nam 38

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Đối tượng nghiên cứu 39

2.1.1 Nhóm bệnh 39

2.1.2 Nhóm chứng 40

2.2 Phương tiện nghiên cứu 40

2.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 40

2.2.2 Hóa chất 41

2.3 Các quy trình, kỹ thuật nghiên cứu 42

2.3.1 Quy trình lấy mẫu 42

2.3.2 Định lượng nồng độ A1AT trong huyết thanh 43

2.3.3 Điện di xác định kiểu hình protein A1AT 45

2.3.4 Giải trình tự xác định kiểu gen A1AT 49

2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 57

2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu 58

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 59

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1 Kết quả định lượng nồng độ A1AT huyết thanh 61

3.1.1 Giá trị trung bình và khoảng nồng độ A1AT huyết thanh 61

3.1.2 So sánh nồng độ A1AT huyết thanh giữa các nhóm 62

3.1.3 Sự phân bố về nồng độ A1AT huyết thanh 62

3.2 Kết quả xác định kiểu hình A1AT bằng kỹ thuật IEF 63

3.2.1 Tỷ lệ các kiểu hình A1AT 63

3.2.2 Một số kiểu hình A1AT gặp trong nghiên cứu 64

3.3 Kết quả xác định kiểu gen A1AT bằng kỹ thuật giải trình tự gen 67

3.3.1 Kết quả giải trình tự exon II và exon V gen SERPINA1 67

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen 71

3.3.3 Kết quả xác định kiểu gen A1AT 80

3.4 Kết quả xác định kiểu gen A1AT đối chiếu với kiểu hình 81

3.5 So sánh nồng độ A1AT huyết thanh theo kiểu hình kiểu gen 82

3.5.1 Phân bố nồng độ A1AT theo kiểu hình, kiểu gen 82

3.5.2 Giá trị ngưỡng nồng độ phát hiện biến thể thiếu hụt (cut-off) 83

3.6 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân theo kiểu gen A1AT 84

3.6.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi và kiểu gen A1AT 84

3.6.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 85

3.6.3 Phân bố giới tính theo kiểu gen 85

3.6.4 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân theo kiểu gen A1AT 86

3.6.5 Kết quả xét nghiệm của bệnh nhân theo kiểu gen A1AT 87

3.6.6 Mô tả bệnh nhân có biến thể Zbristol 88

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 89

4.1 Nồng độ và sự thiếu hụt protein A1AT ở trẻ bị bệnh về gan 89

4.2 Kiểu hình, kiểu gen và các biến thể protein A1AT ở trẻ bị bệnh gan 92

4.2.1 Tỷ lệ kiểu hình, kiểu gen và đặc điểm của các biến thể A1AT 92

4.2.2 Kết quả phát hiện các biến thể A1AT 96

4.3 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân theo kiểu gen A1AT 98

4.4 Chẩn đoán đột biến gen và phát hiện các biến thể A1AT ở trẻ bệnh gan…. 101

4.4.1 Phương pháp chẩn đoán đột biến gen và phát hiện các biến thể A1AT … 101

4.4.2 Giá trị cut-off để phát hiện biến thể thiếu hụt 108

4.4.3 Sơ đồ tiếp cận chẩn đoán đột biến gen A1AT ở trẻ bị bệnh gan 110

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Quốc Chiến, Phạm Thiện Ngọc, Bạch Vọng Hải (1998), “Nồng độ alpha 1 antitrypsin huyết thanh người lớn bình thường”, Hóa sinh y học, 40-43.
2. Hoàng Thị Bích Ngọc, Lê Thị Thu (2001), “Nồng độ alpha 1 antitrypsin ở bệnh nhân viêm gan mạn”, Tạp chí nghiên cứu y học, 14 (1), 18-20.
3. Lê Thị Lan Ngọc (2006), Nghiên cứu tình hình các bệnh gan mật trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung Ương trong 10 năm từ năm 1996 – 2005. Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa cấp II. Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
4. Phạm Thiện Ngọc, Hoàng Thị Bích Ngọc, Hoàng Thu Hà (2002), “Tinh chế Alpha 1 antitrypsin từ huyết tương người”, Y học Việt Nam, 7, 32-41.
5. Phạm Hùng Vân (2009), Real-time PCR – Các vấn đề cơ bản. PCR và real-time PCR – Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản Y học34-59.

Leave a Comment