Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen RPOB,KATG và INHA của vi khuẩn trong lao phổi tái phát

Lao là bệnh lưu hành trên toàn thế giới, nó đã tồn tại cùng với loài người từ hàng ngàn năm trước. Với thời gian, bệnh này đáng lẽ đã được đẩy lùi nhưng đến cuối của thế kỷ 20 cùng với sự phát triển của đại dịch HIV/AIDS, bệnh lao không những không thuyên giảm mà có xu hướng gia tăng ở nhiều nước kể cả các nước phát triển. Mỗi năm trên thế giới có khoảng 8,8 triệu người mắc lao mới và 1,4 triệu người chết vì căn bệnh này, trong khi đó tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lao ước tính chỉ đạt 63%. Điều này đồng nghĩa với việc còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục trở thành nguồn lây bệnh cho cộng đồng [201].

Theo số liệu báo cáo tại hội nghị tổng kết của CTCLQG năm 2010, số bệnh nhân lao năm 2009 của nước ta vào khoảng hơn 98 nghìn người, trong đó tỷ lệ bệnh nhân lao phổi tái phát, thất bại và tái trị là 8.131 chiếm 8,3% tổng số bệnh nhân lao tăng hơn so với năm 2008 (7.534) [9]. Lao phổi tái phát là một bệnh nặng, chẩn đoán khó do dễ nhầm với nhiều nguyên nhân gây bệnh khác ở đường hô hấp sau điều trị lao phổi, tỷ lệ điều trị khỏi thấp và tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn lao cao (kháng thuốc chung là 66,5% – 85,9%; kháng đa thuốc là 30% – 62,9%) [5][18]. Vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân chính dẫn đến thất bại trong điều trị. Đây là thách thức khiến cho mọi nỗ lực của CTCLQG nhằm khống chế, tiến tới thanh toán bệnh lao càng trở nên khó khăn hơn. Việc phát hiện sớm, quản lý, điều trị để ngăn chặn sự lan tràn trong cộng đồng chủng vi khuẩn lao kháng thuốc từ nhiều nguồn, đặc biệt từ bệnh nhân lao phổi tái phát là một trong những vấn đề quan trọng nhất của chiến lược điều trị lao hiện nay.

Từ trước đến nay, việc phát hiện và chẩn đoán lao nói chung cũng như lao kháng thuốc nói riêng đều dựa vào kỹ thuật soi trực tiếp, nuôi cấy và làm kháng sinh đồ. Phương pháp soi trực tiếp cho kết quả nhanh nhưng phải có số lượng vi khuẩn lao >104 vi khuẩn /1ml bệnh phẩm mới phát hiện được. Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein Jensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhưng lại mất nhiều thời gian (4 – 8 tuần). Trên hệ thống nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất 2 tuần, nếu làm kháng sinh đồ lao mất thêm ít nhất 2 tuần nữa, do vậy khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [42].

Kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã khắc phục được những nhược điểm trên, nó cho phép chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao trong vòng 1-2 ngày. Gần đây với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, kỹ thuật multiplex Realtime-PCR, Genotype MTBDRp/ws và gần hơn nữa là Xpert MTB/RIF đã đưa việc chẩn đoán lao kháng thuốc có bước tiến bộ vượt bậc, đó là rút ngắn thời gian chẩn đoán lao kháng thuốc từ 4-8 tuần theo cách nuôi cấy tự nhiên xuống còn 2-3 ngày, mà thậm chí là 2 giờ [74][98][105][141] .

Ở Việt Nam có nhiều đề tài nghiên cứu về lao nói chung, lao phổi, lao kháng thuốc nói riêng, song chưa có đề tài mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân lao phổi tái phát có vi khuẩn kháng đa thuốc, không kháng đa thuốc và còn nhạy cảm với thuốc lao; cũng chưa có đề tài xác định tỷ lệ đột biến gen rpoB, katG và inhA khi vi khuẩn kháng với rifampicin và hoặc isoniazid ở bệnh nhân lao phổi tái phát; cũng chưa có công trình đánh giá hiệu quả chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc của hai kỹ thuật sinh học phân tử Genotye MTBDRp/ws và Multiplex Realtime-PCR ở những bệnh nhân này. Chính vì vậy đề tài này của chúng tôi nhằm các mục tiêu:

1. Xác định một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân lao phổi tái phát có vi khuẩn nhạy cảm, không kháng đa thuốc và kháng đa thuốc

2. Xác định tỷ lệ đột biến của gen rpoB, katG, inhA của vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid ở bệnh nhân lao phổi tái phát.

3. Xác định giá trị chẩn đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin và hoặc isoniazid của Genotype MTBDRplus và Multiplex Realtime-PCR ở bệnh nhân lao phổi tái phát.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO HIỆN NAY 3

1.1.1. Trẽn thế giới: 3

1.1.2. Ở Việt Nam 4

1.1.3. Lao kháng thuốc – thách thức đối với việc khống chế, thanh toán bệnh lao

hiện nay 5

1.2. NGHIÊN CỨU VỀ LAO PHỔI TÁI PHÁT 6

1.2.1. Định nghĩa 6

1.2.2. Đặc điểm lâm sàng 7

1.2.2.1. Toàn thân: 7

1.2.2.2. Cơ năng: 8

1.2.2.3. Thực thể 10

1.2.3. Đặc điểm cận lâm sàng 11

1.2.3.1. Các xét nghiệm cơ bản: 11

1.2.3.2. Xét nghiệm vi khuẩn từ đờm: 11

1.2.3.3. Xquang tim phổi chuẩn: 13

1.2.3.4. Xét nghiệm mô bệnh học 14

1.2.3.5. Các xét nghiệm khác 15

1.2.4. Phân loại bệnh nhân lao phổi tái phát 15

1.3. KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO 16

1.3.1. Định nghĩa kháng thuốc 16

1.3.2. Phân loại kháng thuốc 16

1.3.3. Cơ chế kháng thuốc 17

1.3.4. Các gen đặc trưng của vi khuẩn lao kháng thuốc 19

1.3.4.1. Gen đặc trưng của vi khuẩn lao 19

1.3.4.2. Gen đặc trưng của vi khuẩn lao kháng thuốc 19

1.4. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 25

1.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình 25

1.4.1.1. Phương pháp truyền thống 26

1.4.1.2. Một số phương pháp kiểu hình mới 27

1.4.2. Phương pháp xác định kiểu gen 29

1.4.2.1. Phương pháp lai trên pha rắn 30

1.4.2.2. Kỹ thuật Realtime-PCR và multiplex Realtime-PCR 33

1.4.3. Giá trị của Genotype MTBDRplus và Multiplex realtime PCR 36

1.4.3.1. Giá trị của kỹ thuật Genotype MTBDRplus 36

1.4.3.2. Giá trị của kỹ thuật Multiplex Realtime-PCR 37

CHƯƠNG 2 38

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38

2.1.1. Bệnh nhân nghiên cứu 38

2.1.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 38

2.1.1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định lao phổi tái phát 38

2.1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán lao ngoài phổi phối hợp: 39

2.1.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ: 39

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 39

2.1.2.1. Thiết kế nghiên cứu: 39

2.1.2.2. Cỡ mẫu: 39

2.1.3. Đạo đức trong nghiên cứu 40

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 41

2.2.1. Nghiên cứu lâm sàng 41

2.2.2. Cận lâm sàng: 42

2.2.2.1. Xét nghiệm máu thường quy: 42

2.2.2.2. Chụp Xquang phổi chuẩn: 42

2.2.2.3. Xét nghiệm đờm tìm AFB 44

2.2.2.4. Kỹ thuật nuôi cấy làm kháng sinh đồ 45

2.2.3. Xác định tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của vi khuẩn lao 46

2.2.3.1. Phát hiện gen kháng thuốc 46

2.2.3.2. Quy trình kỹ thuật: 46

2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 50

MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU 54

CHƯƠNG III 55

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 55

3.1. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG THEO TỪNG NHÓM BỆNH 55

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng theo từng nhóm bệnh nhân 55

3.1.1.1. Đặc điểm tuổi và giới 55

3.1.1.2. Thời gian tái phát 57

3.1.1.3. Các tổn thương lao ngoài phổi phối hợp 57

3.1.1.4. Mắc các bệnh phối hợp 58

3.1.1.5. Đặc điểm về lần điều trị lao đầu tiên 58

3.1.1.6. Đặc điểm về triệu chứng lâm sàng: 60

3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng theo từng nhóm bệnh nhân 63

3.1.2.1. Đặc điểm về tổn thương trên Xquang 63

3.1.2.2. Kết quả xét nghiệm máu thường qui của mỗi nhóm 67

3.1.2.3. Kết quả xét nghiệm đờm 68

3.1.3. Một số yếu tố liên quan đến bệnh lao kháng thuốc 71

3.2. TỶ LỆ XUẤT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN rpoB, katG, inhA Ở 2 NHÓM VI KHUẨN KHÁNG THUỐC 73

3.2.1. Thực hiện bằng kỹ thuật Genotype MTBDRplus 73

3.2.1.1. Tỷ lệ xuất hiện các đột biến trên gen rpoB 73

3.2.1.2. Tỷ lệ xuất hiện các đột biến trên gen katG 74

3.2.1.3. Tỷ lệ xuất hiện các đột biến trên gen inhA 75

3.2.2. Thực hiện bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR 77

3.3. GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 78

3.3.1. Giá trị của kỹ thuật Genotype MTBDRplus 78

3.3.2. So sánh giá trị của kỹ thuật Genotype MTBDRplus thực hiện ở chủng và đờm 80

3.3.3. So sánh giá trị của kỹ thuật multiplex Realtime-PCR và Genotype

MTBDRplus 82

CHƯƠNG IV 84

BÀN LUẬN 84

4.1. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG THEO TỪNG NHÓM BÊNH 84

4.1.1. Đặc điểm lâm sàng 84

4.1.1.1. Đặc điểm tuổi và giới 84

4.1.1.2. Thời gian tái phát 86

4.1.1.3. Các tổn thương lao ngoài phổi phối hợp 87

4.1.1.4. Mắc các bệnh phối hợp 87

4.1.1.5. Đặc điểm về lần điều trị lao đầu tiẽn 88

4.1.1.6. Đặc điểm lâm sàng theo từng nhóm bệnh 89

4.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng theo từng nhóm bệnh 93

4.1.2.1. Đặc điểm X quang theo từng nhóm bệnh nhân 93

4.1.2.2. Đặc điểm xét nghiệm máu thường quy của 3 nhóm bệnh nhân 96

4.1.2.3. Đặc điểm xét nghiệm đờm 97

4.1.3. Một số yếu tố liẽn quan đến bệnh lao kháng thuốc 100

4.2. TỶ LỆ XUẤT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN rpoB, katG, inhA Ở HAI NHÓM VI KHUẨN KHÁNG THUỐC 101

4.2.1. Thực hiện bằng kỹ thuật Genotype ® MTBDRplus 102

4.2.2. Thực hiện bằng kỹ thuật Multiplex realtime-PCR 105

4.3. GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 107

4.3.1. Giá trị của kỹ thuật Genotype MTBDRplus 107

4.3.2. So sánh giá trị của hai kỹ thuật Genotype MTBDRplus và multiplex

Realtime-PCR 110

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 116