NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE VÙNG GEN INTERFERON REGULATORY FACTOR 6 (IRF6) VỚI DỊ TẬT BẨM SINH KHE HỞ MÔI-VÒM MIỆNG KHÔNG HộI CHứNG ở NGƯờI VIệT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE VÙNG GEN INTERFERON REGULATORY FACTOR 6 (IRF6) VỚI DỊ TẬT BẨM SINH KHE HỞ MÔI-VÒM MIỆNG KHÔNG HộI CHứNG ở NGƯờI VIệT.Khe hở môi / vòm miệng (KHM/VM) là một dị tật bẩm sinh phổ biến có nguyên nhân phức tạp. Trong bối cảnh tỉ lệ dị tật KHM/VM ở nước ta cao, ảnh hưởng nặng nề và lâu dài về tài chính đối với trẻ mắc KHM/VM, tạo một gánh nặng cho xã hội nước ta và hiện chưa có nhiều nghiên cứu để xác định cơ chế bệnh sinh của dị tật này, điều này cho thấy sự cấp thiết nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân của KHM/VM ở người Việt, từ đó có thể hướng tới việc ứng dụng vào tư vấn di truyền trước sinh và gia tăng hiểu biết về hệ di truyền của bệnh nhân và cơ chế bệnh sinh của dị tật KHM/VM. Đó cũng là một mục tiêu của y học cá thể hoá, góp phần vào mục tiêu chung giảm thiểu tỉ lệ trẻ sinh ra bị dị tật KHM/VM ở người Việt.

KHM/VM có thể xảy ra độc lập hoặc là một phần của những hội chứng di truyền, biến đổi nhiễm sắc thể (NST) hoặc quái thai. Mặc dù đã có những nỗ lực trong việc xác định yếu tố gây bệnh, nguyên nhân gây nên dị tật bẩm sinh KHM/VM không hội chứng (xảy ra độc lập) vẫn còn chưa rõ ràng. Bởi vì KHM/VM hội chứng (xảy ra trong các hội chứng dị tật bẩm sinh vùng hàm mặt) thường có nguyên nhân đơn gen trong khi KHM/VM không hội chứng lại có nguyên nhân đa gen nên việc xác định nguyên nhân di truyền của KHM/VM không hội chứng gặp nhiều khó khăn hơn. Gần đây, ứng dụng kết hợp dịch tễ học, xác định kiểu hình cẩn thận, nghiên cứu tương quan toàn hệ gen (GWAS: Genome-Wide Association Study) và phân tích những mô hình trên động vật, một số yếu tố nguy cơ di truyền và môi trường khác nhau đã được xác định đối với dị tật bẩm sinh KHM/VM không hội chứng. Những phát hiện này đã nâng cao hiểu biết của chúng ta về sinh bệnh học và mở ra cơ hội mới cho các nghiên cứu ứng dụng trên lâm sàng. Những thành công gần đây trong nghiên cứu tương quan toàn hệ gen đã xác định được những vị trí mới liên quan có ý nghĩa thống kê với KHM/VM không hội chứng1. Những nhà nghiên cứu gần đây cố gắng xác định những biến thể nguyên nhân tại những vị trí mới này để hiểu được quá trình phát triển rối loạn dẫn tới KHM/VM không hội chứng2.
Các biến thể của gen IRF6(là gen mã hóa cho yếu tố điều hoà interferon 6) có liên quan một cách nhất quán với KHM/VM trong nhiều nghiên cứu ở các quần thể khác nhau trên thế giới. Đầu tiên, đột biến gen IRF6được xác định là nguyên nhân gây ra hội chứng van der Woude di truyền trội trên NST thường, bệnh bao gồm KHM/VM và/hoặc chỉ khe hở vòm miệng (KHVM) cùng với những bất thường về răng và môi3. Những nghiên cứu bổ sung đã cho thấy các biến thể trên gen IRF6có liên quan đến KHM/VM không hội chứng. Các nghiên cứu trên nhiều quần thể khác nhau trên thế giới đã cho thấy mối liên quan giữa các đa hình đơn nucleotide (SNP) trên gen IRF6với dị tật bẩm sinh KHM/VM không hội chứng. Mối liên quan này đã được xác định một cách độc lập ở một số nghiên cứu lặp lại, tuy nhiên kết quả còn nhiều mâu thuẫn ở những quần thể khác nhau trên thế giới. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm xác định liên quan giữa biến thể gen IRF6với dị tật bẩm sinh KHM/VM không hội chứng ở người Việt.
Câu hỏi nghiên cứu: có mối liên quan giữa các đa hình đơn nucleotide mục tiêu của gen IRF6với dị tật khe hở môi/vòm miệng ở người Việt không?
Nghiên cứu được thực hiện với các mục tiêu dưới đây:
Mục tiêu tổng quát: Xác định mối liên quan giữa các đa hình đơn nucleotide mục tiêu của gen IRF6với dị tật bẩm sinh khe hở môi / vòm miệng ở người Việt.
Mục tiêu chuyên biệt:
1.    Khảo sát đặc điểm lâm sàng và phân loại kiểu hình khe hở môi / vòm miệng.
2.    Xác định tần suất alen và kiểu gen các đa hình đơn nucleotide mục tiêu của gen IRF6ở người Việt khỏe mạnh và người mắc dị tật khe hở môi / vòm miệng.
3.    Phân tích mối liên quan mỗi đa hình đơn nucleotide mục tiêu với dị tật bẩm sinh khe hở môi / vòm miệng ở người Việt.
4.    Phân tích mối liên quan các haplotype (kiểu gen đơn bội) của các đa hình đơn nucleotide mục tiêu của gen IRF6 với dị tật bẩm sinh khe hở môi/vòm miệng ở người Việt.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT    iv
DANH MỤC CÁC BẢNG    v
DANH MỤC CÁC HÌNH    vii
MỞ ĐẦU    1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU    3
1.1    Dịch tễ học của dị tật KHM/VM    3
1.2    Nguyên nhân    4
1.3    Cơ chế hình thành KHM/VM    5
1.4    Phân loại kiểu hình và ý nghĩa với xác định nguyên nhân    dị tật    9
1.5    Ảnh hưởng của KHM/VM lên sức khỏe toàn thân    13
1.6    Điều trị dị tật KHM/VM    13
1.7    Nghiên cứu di truyền KHM/VM    14
1.8    Những nghiên cứu về gen IRF6và các biến thể thuộc gen    IRF6    19
1.9    Kỹ thuật xác định biến thể gen IRF6    26
1.10    Tình hình nghiên cứu di truyền của dị tật KHM/VM ở Việt Nam    28
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    30
2.1    Thiết kế nghiên cứu    30
2.2    Thời gian và địa điểm nghiên cứu    30
2.3    Đối tượng nghiên cứu    30
2.4    Cỡ mẫu của nghiên cứu    31
2.5    Các biến số độc lập và phụ thuộc    32
2.6    Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu    33
2.7    Quy trình nghiên cứu    35
2.8    Phương pháp phân tích dữ liệu    40
2.9    Đạo đức trong nghiên cứu    41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ     42
3.1    Đặc điểm lâm sàng và phân loại kiểu hình    42
3.2    Tần suất alen và tần suất kiểu gen của các SNP mục tiêu    47
3.3    Mối liên quan giữa các SNP mục tiêu và dị tật KHM/VM    55
3.4    Mối liên quan giữa các haplotype với KHM/VM ở người Việt    59
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN    69
4.1    Đặc điểm lâm sàng và phân loại kiểu hình    69
4.2    Tần suất alen và tần suất kiểu gen của các SNP mục tiêu    70
4.3    Mối liên quan giữa các SNP mục tiêu và dị tật KHM/VM    73
4.4    Mối liên quan giữa các haplotype với KHM/VM ở người Việt    82
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ    90
KẾT LUẬN    90
KIẾN NGHỊ    91 
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tỉ lệ trẻ sinh ra mắc dị tật KHM/VM trên thế giới    3
Bảng 2.1. Các đa hình đơn mục tiêu vùng gen IRF6    32
Bảng 2.2. Các phân nhóm kiểu hình và quy ước viết tắt    32
Bảng 2.3. Thông tin về vị trí và trình tự các cặp mồi dùng trong giải trình tự của tám SNP mục tiêu và kích thước sản phẩm PCR tương ứng    
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR    
Bảng 2.5. Thành phần các chất cho phản ứng Cycle Sequencing cho đĩa 96 giếng
Bảng 2.6. Lượng DNA cần cho phản ứng Cycle Sequencing    
Bảng 2.7. Chu trình luân nhiệt Cycle Sequencing    
Bảng 3.1. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2073487 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    48
Bảng 3.2. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs861019 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    49
Bảng 3.3. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2236907 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    50
Bảng 3.4. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2013162 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    51
Bảng 3.5. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs595918 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    52
Bảng 3.6. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2235375 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    53
Bảng 3.7. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2235371 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    54
Bảng 3.8. Tần suất alen và tần suất kiểu gen của SNP rs2235373 giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với cân bằng Hardy – Weinberg    55
Bảng 3.9. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2073487 vùng gen IRF6 với dị tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    56
Bảng 3.10. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs861019 vùng gen IRF6 với dị tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    56
Bảng 3.11. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2236907 vùng gen IRF6 với dị
tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    57
Bảng 3.12. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2013162 vùng gen IRF6 với dị
tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    57
Bảng 3.13. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs595918 vùng gen IRF6 với dị tật
khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    58
Bảng 3.14. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2235375 vùng gen IRF6 với dị
tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    58
Bảng 3.15. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2235371 vùng gen IRF6 với dị
tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    59
Bảng 3.16. OR (95% CI) cho mối liên quan giữa rs2235373 vùng gen IRF6 với dị
tật khe hở môi/vòm miệng và các phân nhóm kiểu hình    59
Bảng 3.17. Kết quả mất cân bằng liên kết giữa từng cặp SNP trong 8 SNP mục tiêu.
Giá trị được biểu thị với D’(R2)    61
Bảng 3.18. Phân tích Haplotype của các SNP mục tiêu vùng gen IRF6 đối với nguy
cơ gây dị tật KHM/VM    63
Bảng 3.19. Phân tích haplotype của 5 SNP mục tiêu vùng gen IRF6 đối với nguy cơ
gây dị tật KHM/VM    65
Bảng 3.20. Kết quả mất cân bằng liên kết giữa từng cặp SNP trong 5 SNP mục tiêu.
Giá trị được biểu thị với D’(R2)    68 
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Tỉ lệ KHM/VM ở các khu vực khác nhau trên thế giới. Quần thể người châu Á và người châu Mỹ có tỉ lệ trẻ dị tật cao nhất theo báo cáo, thường cao tới 1/500 (0,002), tỉ lệ dị tật ở châu Âu là 1/1000 (0,001)    4
Hình 1.2. Các nụ mặt    7
Hình 1.3. Sự ráp dính của các nụ mặt    7
Hình 1.4. A – Thất bại quá trình trung bì hóa dẫn đến khe hở. B – Trung bì hóa quá sớm hoặc quá trễ    9
Hình 1.5. Các phân loại kiểu hình của KHM (1 bên và 2 bên), KHVM (bộ phận và toàn bộ)    10
Hình 1.6. Vị trí gen IRF6 trên NST số 1    19
Hình 1.7. Vị trí phân tử của gen IRF6 từ cặp base 209.785.623 tới 209.806.175 .. 20 Hình 1.8. Cấu trúc gen IRF6. Protein IRF6 dự đoán chứa một miền liên kết DNA có cánh xoắn (màu vàng) và miền liên kết với protein SMIR /IAD (màu xanh lá cây)      21
Hình 1.9. Mô hình protein của IRF6    21
Hình 1.10. Đột biến trên gen IRF6 gây ra VWS và PPS với 2 phả hệ VWS và 1 phả
hệ PPS    23
Hình 1.11. Hội chứng van der Woude (VWS) với hố môi dưới kèm KHM – VM . 23
Hình 1.12. Nguyên tắc của phương pháp PCR    27
Hình 2.1. Máy luân nhiệt Eppendorf Mastercycler EP 384 Thermal Cycler (Thermo
Scientific)    33
Hình 2.2. Máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystem)      34
Hình 2.3. Thang chuẩn DNA 1kp plus    39
Hình 3.1. Phân bố theo tuổi    42
Hình 3.2. Phân bố theo giới    43
Hình 3.3. Phân bố kiểu hình    43
Hình 3.4. Trẻ bị dị tật khe hở môi kèm theo khe hở vòm miệng (KHM-VM)    44
Hình 3.5.    Trẻ chỉ bị khe hở môi (KHM)    45
Hình 3.6.    Trẻ chỉ bị khe hở vòm miệng (KHVM)    46
Hình 3.7.    Hình ảnh các alen C và T của rs2073487 trong kỹ thuật Sanger    47
Hình 3.8. Các khối mất cân bằng liên kết giữa từng cặp SNP trong 8 SNP mục tiêu. Khối màu đỏ biểu thị cho sự liên kết mạnh giữa 2 SNP, khối màu hồng biểu thị cho sự liên kết trung bình giữa 2 SNP, khối màu trắng biểu thị cho sự liên kết yếu giữa
2 SNP    61
Hình 3 9. Phân tích haplotype cửa sổ trượt của 5 SNP mục tiêu với giá trị p    67
Hình 3.10. Các khối mất cân bằng liên kết từng cặp SNP trong 5 SNP mục tiêu. .. 68