Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản. Bất thường sinh sản (BTSS) bao gồm các tình trạng có ảnh hưởng không tốt đến việc sinh ra một đứa trẻ khỏe mạnh. Theo hướng dẫn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khỏe sinh sản thì các bất thường sinh sản bao gồm các bất thường về thai nghén, chuyển dạ và sinh đẻ.1 Có rất nhiều nguyên nhân gây bất thường sinh sản như: do rối loạn vật chất di truyền, do các tác nhân vật lý, hóa học, sinh học tác động từ môi trường, do cơ thể bố mẹ…. 2,3 trong đó nguyên nhân do rối loạn vật chất di truyền vẫn là phức tạp và khó xác định nhất.

Các bất thường sinh sản gây ra nhiều hậu quả nặng nề cho sức khỏe, tâm lý người mẹ, cho gia đình và cho cả xã hội. Do đó việc tìm ra nguyên nhân, cách phòng tránh và khắc phục các bất thường sinh sản nói trên luôn là vấn đề được quan tâm, nghiên cứu. Cơ chế gây bất thường sinh sản phụ thuộc vào các nguyên nhân như: các nguyên nhân từ phôi hoặc thai thường do rối loạn về vật chất di truyền, các nguyên nhân từ mẹ thường có cơ chế như: rối loạn nội tiết 5- 7, cơ chế miễn dịch8 hay cơ chế huyết khối làm tắc mạch máu nuôi dưỡng thai.9,10 Các yếu tố liên quan đến cơ chế huyết khối đã được biết đến như tăng nồng độ homocystein (Hcy) huyết thanh hay một số yếu tố di truyền bao gồm sự thiếu hụt antithrombin, protein C và protein S, các yếu tố đột biến gen V Leiden, yếu tố II (G20210A) hoặc gen MTHFR.10 Gen Methylene Tetra Hydro Folate Reductase (MTHFR) là một gen nằm ở vùng 36.3 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 1. Đa hình gen MTHFR thường xảy ra tại hai vị trí 677 và 1298.11 Trong một số nghiên cứu quần thể người da trắng, tần suất của đa hình dị hợp tử 677CT thường xảy ra ở khoảng 35% dân số, đa hình đồng hợp tử 677TT là khoảng 5-10% dân số. Đa hình đồng hợp tử của 1298CC xảy ra ở 9% dân số.12 Gen MTHFR sản xuất enzym MTHFR xúc tác quá trình chuyển hóa Hcy thành methionin. Enzym này có tác dụng xúc tác chuyển 5,10-2 methylene THF thành 5-methyl THF. 5-methyl THF hoạt động như chất trung
gian để chuyển homocystein thành methionin.13 Vì vậy, khi gen MTHFR bị biến đổi, homocystein không được chuyển hóa dẫn đến nồng độ tăng cao trong máu. Nồng độ homocystein tăng cao trong máu được xem là nguyên nhân gây xơ vữa, hẹp lòng động mạch, gây tắc mạch, huyết khối, tăng hình thành cục máu đông.14 Việc tăng hình thành huyết khối xảy ra ở vi mạch tiếp nối giữa nhau thai và thành tử cung sẽ gây bất thường thai sản như sẩy thai, thai chết lưu.14
Bên cạnh đó, nồng độ homocystein tăng cao có thể được hạn chế bởi vai trò của folat.15 Nồng độ cao folat dẫn tới việc tăng ái lực với cofactor FAD,16 ngăn ngừa chứng tăng homocystein. Folat là một loại vitamin cần thiết để hình thành nên tế bào mới và còn giúp cho sự phân chia tế bào,17 vì vậy thiếu folat thường liên quan với các bất thường cấu trúc trong quá trình phát triển phôi thai.
Từ những nghiên cứu định hướng về vai trò của gen MTHFR liên quan đến nồng độ homocystein và folat, câu hỏi đặt ra là nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR trong cơ thể mẹ có liên quan đến nguy cơ bất thường sinh sản và dị tật bẩm sinh hay không? Câu trả lời sẽ rất có ý nghĩa trong: dự đoán nguyên nhân bất thường sinh sản như sẩy thai, thai chết lưu, thai dị tật ống thần kinh; trong việc điều trị chứng tăng đông máu gây bất thường thai sản; và trong dự phòng nguy cơ bất thường thai sản.
Với những lý do và lợi ích của các xét nghiệm gen MTHFR, folat và homocystein, đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản” được thực hiện với mục tiêu:
1. Xác định nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có tiền sử thai chết lưu tái diễn.
2. Đánh giá mối liên quan giữa nồng độ homocystein, folat huyết thanh và tính đa hình gen MTHFR trong dự báo nguy cơ thai chết lưu

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………………………………1
Chương 1: TỔNG QUAN ………………………………………………………………………………3
1.1. Tổng quan về bất thường sinh sản …………………………………………………. 3
1.1.1. Vô sinh…………………………………………………………………………………. 3
1.1.2. Các bất thường thai sản…………………………………………………………… 3
1.1.3. Nguyên nhân của bất thường sinh sản………………………………………. 9
1.1.4. Cơ chế liên quan đến bất thường sinh sản ……………………………….. 12
1.2. Vai trò của homocystein, folat và đa hình gen MTHFR………………….. 16
1.2.1. Vai trò của homocystein ……………………………………………………….. 16
1.2.2. Vai trò của folat …………………………………………………………………… 22
1.2.3. Đa hình gen MTHFR ……………………………………………………………. 26
1.3. Các phương pháp định lượng nồng độ homocystein, folat và xác định đa
hình gen MTHFR………………………………………………………………………. 30
1.3.1. Các phương pháp định lượng nồng độ Hcy……………………………… 30
1.3.2. Các phương pháp xét nghiệm folat…………………………………………. 32
1.3.3. Các phương pháp phát hiện đa hình gen MTHFR…………………….. 33
1.4. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa homocystein, folat và đa hình gen
MTHFR……………………………………………………………………………………. 35
1.4.1. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ homocystein, folat
huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở người khỏe mạnh ………….. 35
1.4.2. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ Hcy, folat và đa hình
gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản …………………………. 36
1.4.3. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ Hcy, folat huyết thanhvà đa hình gen MTHFR ở một số bệnh lý khác………………………… 38
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….40
2.1. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………………………… 40
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu ……………………………… 40
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ……………………………………………………………….. 40
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ………………………………………….. 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………. 41
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………… 41
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu………………………………………………………………. 41
2.3. Thu thập mẫu và biến số nghiên cứu ……………………………………………. 44
2.3.1. Các bước tiến hành ………………………………………………………………. 44
2.3.2. Biến số nghiên cứu……………………………………………………………….. 45
2.4. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu……………………………… 46
2.4.1. Trang thiết bị, dụng cụ………………………………………………………….. 46
2.4.2. Hóa chất ……………………………………………………………………………… 46
2.5. Quy trình kỹ thuật ……………………………………………………………………… 47
2.5.1. Quy trình xét nghiệm Hcy, folat …………………………………………….. 47
2.5.2. Kiểm soát chất lượng và báo cáo kết quả ………………………………… 48
2.5.3. Phát hiện đa hình gen MTHFR……………………………………………… 49
2.6. Xử lý và phân tích số liệu …………………………………………………………… 52
2.6.1. Xử lý số liệu………………………………………………………………………… 52
2.6.2. Xây dựng ngưỡng cắt tối ưu cho chẩn đoán tăng nồng độ
homocystein và folat huyết thanh …………………………………………… 52
2.7. Xây dựng mô hình tiên lượng……………………………………………………… 53
2.8. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu………………………………………………… 53
2.9. Các biện pháp tránh sai số ………………………………………………………….. 542.10. Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………………………….. 54
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………………56
3.1. Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu……………………………………. 56
3.2. Nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR……. 57
3.2.1. Nồng độ homocystein và folat huyết thanh ở nhóm nghiên cứu…. 57
3.2.2. Đánh giá đa hình gen MTHFR ………………………………………………. 57
3.2.3. Đa hình gen MTHFR trên đối tượng nghiên cứu ……………………… 65
3.3. Mối tương quan giữa nồng độ Hcy và folat huyết thanh theo đa hình gen
MTHFR……………………………………………………………………………………. 71
3.3.1. So sánh nồng độ Hcy theo các đa hình gen MTHFR ………………… 71
3.3.2. So sánh nồng độ folat theo các đa hình gen MTHFR………………… 72
3.3.3. Mối tương quan giữa nồng độ Hcy và folat với tổ hợp đa hình 2 vị trí
C677T và A1298C trên gen MTHFR ……………………………………… 72
3.3.4. Mối tương quan nồng độ Hcy và folat huyết thanh…………………… 74
3.3.5. Đánh giá mô hình nghiên cứu………………………………………………… 75
Chương 4: BÀN LUẬN ………………………………………………………………………………..88
4.1. Nồng độ folat, homocystein huyết thanh ở bệnh nhân có tiền sử thai chết
lưu tái diễn………………………………………………………………………………… 90
4.2. Sự liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và đa hình gen
MTHFR ở bệnh nhân có tiền sử thai chết lưu tái diễn…………………… 113
KHUYẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………………126
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO………………………………………………………127
CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…128
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Quy định về thai chết lưu ở một số nước……………………………………..5
Bảng 2.1: Hằng số C liên quan đến sai sót loại I và II ………………………………..42
Bảng 2.2: Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen liên quan đến thai chết lưu tái phát
theo mức sai sót loại I và II ……………………………………………………….42
Bảng 2.3: Ước tính cỡ mẫu theo sự biến thiên của homocystein liên quan đến
sẩy thai và/hoặc thai chết lưu tương ứng với các mức sai sót loại I và
II………………………………………………………………………………………………43
Bảng 2.4. Kết quả tính cỡ mẫu tương ứng cho mỗi nhóm với mức α, β………43
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng ……………………………………………………………….49
Bảng 2.6. Chu kì nhiệt của phản ứng realtime PCR……………………………………49
Bảng 2.7. Trình tự mồi của phản ứng sequencing………………………………………51
Bảng 2.8. Chu kì nhiệt của sequencing ……………………………………………………..51
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu……………………………………..56
Bảng 3.2. So sánh nồng độ Hcy và folat huyết thanh theo tuổi …………………..56
Bảng 3.3. So sánh kết quả Hcy và folat của nhóm bệnh và nhóm chứng…….57
Bảng 3.4. Tỷ lệ xuất hiện của alen C và T vị trí 677…………………………………..65
Bảng 3.5. Phân bố kiểu gen MTHFR C677T trong nhóm nghiên cứu ………..65
Bảng 3.6. Nguy cơ thai chết lưu tái diễn theo đa hình gen MTHFR vị trí 677…66
Bảng 3.7. Tỷ lệ xuất hiện alen C ở vị trí 1298……………………………………………68
Bảng 3.8. Phân bố kiểu gen MTHFR A1298C trong nhóm nghiên cứu……..68
Bảng 3.9. Nguy cơ có bệnh theo đa hình MTHFR vị trí 1298…………………….69
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của đa hình gen khi kết hợp cả 2 vị trí đa hình trên gen
MTHFR……………………………………………………………………………………70
Bảng 3.11. Nồng độ Hcy (μmol/L) theo các đa hình gen MTHFR……………….71
Bảng 3.12. Nồng độ folat (ng/mL) theo các đa hình gen MTHFR………………..72Bảng 3.13. So sánh nồng độ Hcy và folae huyết thanh theo các tổ hợp đồng hợp
tử kiểu dại và dị hợp tử kép……………………………………………………….72
Bảng 3.14. So sánh nồng độ homocystein và folat huyết thanh theo tổ hợp gen
dị hợp tử kép và đa hình đồng hợp tử kép ………………………………….73
Bảng 3.15. So sánh nồng độ homocystein và folae huyết thanh theo tổ hợp gen
đồng hợp tử kiểu dại kép với đa hình đồng hợp tử kép………..73
Bảng 3.16. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu………………………………………….75
Bảng 3.17. Xác định ngưỡng cắt tối ưu theo d-distance, BM, F1 score, BAC.79
Bảng 3.18. Xác định mô hình tối ưu dựa trên các biến nghiên cứu……………….82
Bảng 3.19. Đánh giá tỷ suất chênh OR của các biến trong mô hình ……………..8

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc 2 và 3 chiều của Homocystein………………………………….16
Hình 1.2. Cơ chế stress oxy hóa của Hcy ……………………………………………….19
Hình 1.3. Nồng độ homocystein và con đường đông máu………………………20
Hình 1.4. Cơ chế gây xơ vữa động mạch của homocystein …………………..22
Hình 1.5. Các dạng cấu trúc của acid folic …………………………………………….23
Hình 1.6. Sự hấp thu Folat trong cơ thể …………………………………………………24
Hình 1.7. Chu trình folat trong chuyển hóa methionin …………………………..25
Hình 1.8. Vị trí phân tử của gen MTHFR trên nhiễm sắc thể số 1………….26
Hình 1.9. Cấu trúc gen MTHFR và các protein được tổng hợp từ gen
MTHFR …………………………………………………………………………………..27
Hình 2.1. Mô phỏng các bước trong quy trình xét nghiệm Hcy và folat ..48
Hình 2.2. Các tiêu chí để xây dựng ngưỡng cắt cho nồng độ Hcy, folat ..53
Hình 3.1. Chứng âm không có DNA ………………………………………………………58
Hình 3.2. Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 677CC ……………………………….58
Hình 3.3. Kết quả chứng kiểu gen MTHFR 1298AA……………………………..59
Hình 3.4. Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 677CT ………………………..59
Hình 3.5. Kết quả chứng dị hợp tử gen MTHFR 1298AC ……………………..60
Hình 3.6. Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 677TT……………………60
Hình 3.7. Kết quả chứng đồng hợp tử gen MTHFR 1298CC …………………61
Hình 3.8. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
1298AA (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12 ..62
Hình 3.9. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
1298CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 20.. 62
Hình 3.10. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
677TT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm chứng số 12….63Hình 3.11. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
677CC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 56..63
Hình 3.12. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
1298AC (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 58…64
Hình 3.13. Hình ảnh realtime PCR (bên trái) và giải trình tự của kiểu gen
677CT (bên phải) của cùng mẫu đối tượng nhóm bệnh số 58 ..6