Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở các nước phát trien và là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở các nước đang phát trien [117]. Gánh nặng về ung thư tiếp tục gia tăng trên diện rộng vì sự già hóa và phát triển dân số, cùng với sự gia tăng các yếu tố nguy cơ gây ung thư. Thống kê của GLOBOCAN năm 2008, trên thế giới có khoảng 12,7 triệu trường hợp ung thư mắc mới và 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư.

Trong đó có 56% trường hợp do ung thư mắc mới và 64% trường hợp do ung thư xảy ra ở các nước phát triển [28]. Dự đoán vào năm 2020, tỷ lệ mắc ung thư sẽ tăng 50%. Ung thư dạ dày (UTDD), ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là hai trong số năm bệnh lý ung thư hàng đầu [28], [59], [60]. Cho tới nay tuy chưa có số liệu điều tra chính xác về dịch tễ học UTDD trong phạm vi cả nước nhưng các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UTDD khá cao trong cộng đồng. Theo ghi nhận ung thư ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, ước tính tỷ lệ mắc UTDD năm 2000 ở nam giới là 23,7/100.000 người, đứng hàng thứ 2 sau ung thư phoi, ở nữ giới là 10,8/100.000 người, đứng hàng thứ 3 sau ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Việt Nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTGNP cao, hiện chưa có số liệu thống kê cụ thể về tình hình ung thư gan trên phạm vi toàn quốc, nhưng theo một số báo cáo tại các cơ sở điều trị lớn trong nước thì ung thư gan là loại hình ung thư đáng báo động. Điều tra của Phạm Hoàng Anh tại 22 cơ sở y tế của Hà Nội năm 2002 cho thấy UTGNP đứng hàng thứ 3 ở nam giới và hàng thứ 6 ở nữ giới [1].

Chẩn đoán UTDD và UTGNP dựa vào chẩn đoán hình ảnh (siêu âm, nội soi, chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ hạt nhân, chụp động mạch gan, chan đoán bằng đồng vị phóng xạ), chẩn đoán tế bào học và mô bệnh học, định lượng nồng độ Alpha Fetoprotein (AFP). Tuy nhiên, chấn đoán UTDD và UTGNP bằng các phương pháp kể trên chỉ chấn đoán được khi khối u đã hình thành, phát triển rõ và thường là giai đoạn muộn của bệnh. Có thể nói chúng ta đang phải đối mặt với cuộc chiến đầy cam go và thách thức nhằm chống lại những mất mát về người và sự tốn kém về kinh tế trong việc điều trị căn bệnh ung thư. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh học của ung thư để từ đó có thể tìm ra phương pháp chấn đoán sớm, điều trị hiệu quả là vấn đề thách thức và được quan tâm đặc biệt của các nhà Y sinh học hiện đại.

Activation Induced cytidine Deaminase (AID) là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) và tái to hợp (class switch recombination) gen kháng thể [78], [80]. Trong điều kiện sinh lý bình thường, sự biểu hiện AID giới hạn tại tế bào lympho B hoạt hóa sinh kháng thể và được kiểm soát chặt chẽ bởi các yếu tố điều hòa [54], [71]. Khi gen AID bị đột biến thì gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch, tăng IgM2 bấm sinh ở người. Mặt khác, ở tế bào không có thấm quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến để khởi đầu cho quá trình ung thư hóa tế bào lành [65], [78], [90], [95]. Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến gen như vậy nên AID được coi như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng. Dưới tác động của các yếu tố hoạt hoá, AID sẽ tác động trực tiếp lên các gen áp chế ung thư, tích lũy đột biến, từng bước làm bất hoạt và mất chức năng của các gen áp chế ung thư này [52] [99].

Gen p53 là gen áp chế ung thư quan trọng nhất, có vai trò ức chế chu trình tế bào, gây apoptosis và tương tác với một số gen để kiểm soát sự tăng sinh, biệt hoá của tế bào [100]. Các nghiên cứu cho thấy, p53 có vai trò quan trọng trong một số bệnh lý ung thư của người. Đột biến hoặc mất gen p53 được phát hiện trên 50% trường hợp ung thư và trên 60% trường hợp UTDD và UTGNP [43], [63].

Kể từ khi gen AID được phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của Gs Tasuku Honjo tại Trường Đại học tong hợp Kyoto, Nhật Bản vào năm 1999 đến nay, đã có nhiều công trình khoa học công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng nhất trên thế giới về vai trò của AID, trong đó có mối liên quan giữa AID và p53 trong sự phát sinh, phát triển UTDD và UTGNP. Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về gen AID trong UTDD và UTGNP. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu mức độ phiên mã gen Activation Induced cytidine Deaminase (AID) và tỷ lệ đột biến gen p53 trong ung thư dạ dày và ung thư gan nguyên phát” được thực hiện với ba mục tiêu:

1. Đánh giá mức độ phiên mã gen AID ở mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát so sánh với mô lành đối chứng.

2. Xác định tỷ lệ đột biến vị trí S249R tại exon 7 của gen p53 ở mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát.

3. Bước đầu tìm hiểu mối tương quan giữa mức độ phiên mã gen AID với đột biến vị trí S249R tại exon 7 của gen p53 trên mô ung thư dạ dày và mô ung thư gan nguyên phát.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. UNG THƯ DẠ DÀY 4

1.1.1. Dịch tễ học 4

1.1.2. Yếu tố nguy cơ 5

1.1.3. Giải phẫu bệnh và phân loại ó

1.1.4. Chẩn đoán ung thư dạ dày 7

1.2. UNG THƯ GAN 9

1.2.1. Dịch tễ học 9

1.2.2. Yếu tố nguy cơ 11

1.2.3. Hình ảnh giải phẫu bệnh 12

1.2.4. Chẩn đoán ung thư gan 13

1.3. CÁC BIẾN ĐỔI PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ GAN VÀ UNG THƯ

DẠ DÀY ló

1.3.1. Gen gây ung thư (oncogene) ló

1.3.2. Gen áp chế ung thư ló

1.3.3. MicroRNA ló

1.4. VAI TRÒ GEN p53 TRONG UNG THƯ 17

1.4.1. Cấu trúc của gen p53 17

1.4.2. Chức năng p53 1S

1.4.3. Gen p53 đột biến 21

1.5. VAI TRÒ GEN AID TRONG UNG THƯ 23

1.5.1. Cấu trúc của gen AID 23

1.5.2. Vai trò sinh học của gen AID 24

1.5.3. Cơ chế hoạt động của gen AID trong quá trình tái tổ hợp gen

kháng thể 25

1.5.4. Đột biến gen AID gây hội chứng tăng IgM bẩm sinh trên người 27

1.5.5. Vai trò gen AID trong ung thư 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1. Đối tượng nghiên cứu 34

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hoá chất nghiên cứu 34

2.3. Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1. Lấy mẫu 38

2.3.2. Quy trình tách chiết DNA 38

2.3.3. Quy trình tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 41

2.3.4. Quy trình xác định đột biến gen p53 44

2.3.5. Đánh giá mức độ phiên mã gen AID bằng kỹ thuật Real-time PCR 49

2.3.6. Xác định HBV DNA bằng kỹ thuật Real time PCR 54

2.4. Xử lý số liệu 55

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM NGHIÊN CỨU 56

3.1.1. Nhóm bệnh nhân gan 56

3.1.2. Nhóm bệnh nhân dạ dày 57

3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA, RNA VÀ TỔNG HỢP cDNA 58

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA 58

3.2.2. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 61

3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN P53 65

3.3.1. Nhóm mô gan 68

3.3.2. Nhóm mô dạ dày 69

3.4. XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID 69

3.4.1. Nhóm mô gan 71

3.4.2. Nhóm mô dạ dày 77

3.5. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID VÀ ĐỘT

BIẾN GEN P53 86

3.5.1. Nhóm mô gan 86

3.5.2. Nhóm mô dạ dày 86

Chương 4: BÀN LUẬN 87

4.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM NGHIÊN CỨU 90

4.1.1. Nhóm bệnh nhân gan 90

4.1.2. Nhóm bệnh nhân dạ dày 91

4.2. KẾT QUẢ VỀ TÁCH CHIẾT DNA, RNA VÀ TỔNG HỢP cDNA…. 91

4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 91

4.2.2. Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 92

4.3. TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 93

4.3.1. Nhóm mô gan 94

4.3.2. Nhóm mô dạ dày 95

4.4. MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID TRÊN MÔ GAN VÀ MÔ DẠ DÀY 96

4.4.1. Nhóm mô gan 98

4.4.2. Nhóm mô dạ dày 100

4.5. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ GEN AID VÀ ĐỘT

BIẾN GEN P53 101

4.5.1. Nhóm mô gan 101

4.5.2. Nhóm mô dạ dày 102

KẾT LUẬN 105

KIẾN NGHỊ 106

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH LẤY MẪU BỆNH NHÂN