Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam

Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam.Ba kích (Morinda officinalis) là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong Y học cổ truyền, được biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt, tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng của dược liệu rễ Ba kích và các chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày một tăng. Thị trường dược liệu rễ Ba kích cũng rất đa dạng, bao gồm các nguồn cung cấp dược liệu được nhập khẩu từ Trung Quốc, được trồng theo quy hoạch phát triển vùng trồng dược liệu [13], và nguồn thu hái tự nhiên. Do đa dạng về nguồn cung cấp nên chất lượng của dược liệu rễ Ba kích chưa được kiểm soát chặt chẽ.

Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn do hình dáng, trong khi việc định danh dược liệu bằng hình thái học là một công tác khó khăn vì sau khi thu hái và xử lý thì không thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu. Cần có một phương pháp bổ trợ trong định danh dược liệu để đảm bảo tính đúng của dược liệu rễ Ba kích, và phương pháp định danh dược liệu bằng giải trình tự ADN là một phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra.
Để kiểm soát được chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu trong đó kiểm soát được đầy đủ các chỉ tiêu về hình thái cũng như một số “marker” (những chất có hoạt tính sinh học hoặc có hàm lượng cao có trong dược liệu [86]). Đồng thời, phải thiết lập được những chất chuẩn của “marker” này để cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí cũng như thời gian kiểm nghiệm so với việc phải mua những chất chuẩn này từ nước ngoài.
Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, hiện nay Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích. Trong đó, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ có một số chỉ tiêu cơ bản về mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định lượng thành phần hóa học [3]. Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông đã có chỉ tiêu định lượng “marker” – nystose [37], [47]. Về “marker” trong dược liệu rễ Ba kích: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về một số hợp chất trong rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [59], hay nhóm anthraquinon và polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu2 xương [89]. Một số công trình khoa học đã công bố hàm lượng các chất monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích cũng ở mức tương đối cao (monotropein: 0,046 % [91], nystose:  3,0% [11]). Do vậy, monotropein và nystose đủ điều kiện là “marker” của dược liệu rễ Ba kích, cần được kiểm soát hàm lượng và thiết lập chất chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích.
Xuất phát từ những vấn đề cấp thiết ở trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam” được thực hiện với 3 mục tiêu chính:
1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích.
2. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN.
3. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………. i
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU …………………………………………………………………. iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ………………………………………………………….. vii
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………………………………………3
1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) ………………………………………3
1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích ……………………………………………………………………3
1.1.2. Đặc điểm hình thái………………………………………………………………………………..3
1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến………………………………………………………………………4
1.1.4. Thành phần hoá học………………………………………………………………………………4
1.1.5. Tác dụng dược lý…………………………………………………………………………………..5
1.1.6. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích……………………………………………..5
1.2. Monotropein và nystose ……………………………………………………………………………6
1.2.1. Monotropein…………………………………………………………………………………………6
1.2.2. Nystose ………………………………………………………………………………………………..8
1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ………………………………12
1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt
Nam ……………………………………………………………………………………………………………12
1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích……………………………..13
1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis
How ……………………………………………………………………………………………………………15
1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật ………………………………………15
1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR) ……………………………………………………..16
1.4.3. Các trình tự gen thường dùng cho thực vật …………………………………………….181.4.4. Nghien cưu vê đa dạng di truyên loài Morinda officinalis How ………………..22
1.6. Tính cấp thiết của luận án ……………………………………………………………………….23
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..25
2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………………………………..25
2.2. Phương tiện nghiên cứu ………………………………………………………………………….25
2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn……………………………………………………………..25
2.2.2. Hóa chất và thuốc thử ………………………………………………………………………….25
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ………………………………………………………………………………….26
2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………………………27
2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose …….27
2.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
…………………………………………………………………………………………………………………..37
2.3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose………………………………………….39
2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN…..44
2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam vê một
số chỉ tieu định tính, định lượng …………………………………………………………………….48
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………………49
3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose……….49
3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein…………………….49
3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose ……………………………54
3.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng ……………………………………………………………………….59
3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích60
3.2.1. Chiết xuất cao chiết toàn phần chưa monotropein và nystose …………………..60
3.2.2. Phân lập và tinh chế monotropein …………………………………………………………61
3.2.3. Phân lập và tinh chế nystose…………………………………………………………………63
3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn……………….653.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose…………………………………………….67
3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein …………………………………………………………67
3.3.2. Thiết lập chất chuẩn nystose…………………………………………………………………75
3.3.3. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích….83
3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN…….85
3.4.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu………………………………………………….85
3.4.2. Nhân bản đoạn gen ……………………………………………………………………………..86
3.4.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu………………………………………………..87
3.4.4. Phân tích trình tự gen ………………………………………………………………………….89
3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số
chỉ tiêu định tính và định lượng ……………………………………………………………………..93
3.5.1. Bổ sung các chỉ tieu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba
kích trong Dược điển Việt Nam………………………………………………………………………93
3.5.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI …..94
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN…………………………………………………………………………..101
4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose……..101
4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược
liệu rễ Ba kích ……………………………………………………………………………………………101
4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ
Ba kích………………………………………………………………………………………………………103
4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC……..105
4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
…………………………………………………………………………………………………………………105
4.2.1. Chiết cao toàn phần …………………………………………………………………………..105
4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein…………………………………………………………..106
4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose…………………………………………………………………..107
4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được ………………………1084.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose…………………………………………..109
4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN…..112
4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số
chỉ tiêu định tính, định lượng ……………………………………………………………………….118
4.5.1. Bổ sung chỉ tieu định tính……………………………………………………………………118
4.5.2. Bổ sung chỉ tieu định lượng ………………………………………………………………..120
4.6. Những đóng góp mới của luận án …………………………………………………………..122
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………123
Kết luận …………………………………………………………………………………………………….123
Kiến nghị…………………………………………………………………………………………………..123
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………….

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda ……………………………………………………….3
Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển ………………….5
Bảng 1.3. Chương trình gradient dung môi định lượng nystose …………………………11
Bảng 1.4. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose……………….13
Bảng 2.1. Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích …………………………………………………25
Bảng 2.2. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52]
…………………………………………………………………………………………………………..29
Bảng 2.3. Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52] ………………..34
Bảng 2.4. Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điêu chế. ………………………38
Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ưng……………………………………..45
Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast …………46
Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84]………………………..46
Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36] …………………46
Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39] ……………47
Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56]………47
Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48] ……………………..47
Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ưng giải trình tự đoạn gen …..48
Bảng 3.1. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein…..49
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein
…………………………………………………………………………………………………………..50
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein
trong nguyên liệu………………………………………………………………………………….51
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein
trong dược liệu BK5 ……………………………………………………………………………..52
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong
nguyên liệu…………………………………………………………………………………………..52iv
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong
dược liệu BK5………………………………………………………………………………………53
Bảng 3.7. Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose…………………….54
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose…………56
Bảng 3.9. Kết quả độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng nystose trong
nguyên liệu…………………………………………………………………………………………..57
Bảng 3.10. Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng nystose trong dược
liệu BK5 ………………………………………………………………………………………………58
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong nguyên
liệu ……………………………………………………………………………………………………..58
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong dược
liệu BK5 ………………………………………………………………………………………………59
Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo
*(D2O, 600 MHz) ………………………………………………………………………………….66
Bảng 3.14. Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo
*(D2O, 100 MHz) ………………………………………………………………………………….67
Bảng 3.15. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein……..68
Bảng 3.16. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein ………………..69
Bảng 3.17. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein……………………70
Bảng 3.18. Số lượng lọ chuẩn monotropein …………………………………………………….70
Bảng 3.19. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein …………………..71
Bảng 3.20. Kết quả đánh giá lien phòng chất chuẩn monotropein ……………………..72
Bảng 3.21. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein …………………………………..72
Bảng 3.22. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng)…….73
Bảng 3.23. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) ………74
Bảng 3.24. Kết quả xác định tạp chất lien quan độ ổn định chất chuẩn monotropein
(6 tháng) ……………………………………………………………………………………………..74v
Bảng 3.25. Kết quả xác định tạp chất lien quan độ ổn định chất chuẩn monotropein
(1 năm)………………………………………………………………………………………………..74
Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả nghiên cưu độ ổn định chất chuẩn monotropein sau 1
năm …………………………………………………………………………………………………….75
Bảng 3.27. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu nystose …………….76
Bảng 3.28. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn nystose …………………………..77
Bảng 3.29. Số lượng lọ chất chuẩn nystose ……………………………………………………..78
Bảng 3.30. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn nystose…………………………..78
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá lien phòng chất chuẩn nystose ……………………………..79
Bảng 3.32. Kết quả hàm lượng chất chuẩn nystose…………………………………………..79
Bảng 3.33. Kết quả định lượng nghiên cưu độ ổn định chất chuẩn nystose (6 tháng)
…………………………………………………………………………………………………………..80
Bảng 3.34. Kết quả định lượng nghiên cưu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm)
…………………………………………………………………………………………………………..81
Bảng 3.35. Tổng hợp kết quả nghiên cưu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm
…………………………………………………………………………………………………………..82
Bảng 3.36. Kết quả định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích …………….83
Bảng 3.37. Kết quả định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích. ……………………84
Bảng 3.38. Kết quả đo mật độ quang của dịch tách chiết ADN toàn phần …………..86
Bảng 3.39. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự ITS…………………………..87
Bảng 3.40. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự matK………………………..88
Bảng 3.41. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự rbcL…………………………88
Bảng 3.42. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự trnH-pbsA ………………..88
Bảng 3.43. Kết quả so sánh độ tương đồng và độ phủ của các mẫu Ba kích so với M.
officinalis KR869730 và M. officinalis AY551330 …………………………………….89
Bảng 3.44. Khoảng cách di truyên của các mẫu trên trình tự ITS ………………………90
Bảng 3.45. Khoảng cách di truyên giữa các mẫu trên trình tự matK…………………..91
Bảng 3.46. Khoảng cách di truyên giữa các mẫu trên trình tự rbcL……………………92vi
Bảng 3.47. Khoảng cách di truyên giữa các mẫu trên trình tự trnH-psbA …………..93
Bảng 3.48. Tóm tắt các chỉ tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của
Dược điển Việt Nam. …………………………………………………………………………….9