Nghiên cúu nhận dạng pháp y bằng phương pháp hình thái học và phân tích adn một sổ locus str ở người Việt

Nhận dạng cá thể người trong pháp y là quá trình phân tích các đặc điểm đặc trưng của con người để xác định một cá thể trong một nhóm đối tượng nhất định nào đó từ các mẫu sinh phẩm thu được nhằm phục vụ cho giám định pháp y và khoa học hình sự như nhận dạng cá thể trong trường hợp mất tích, nhận dạng các phần thân thể bị tách rời, xác định người cha, người con (trong quan hê huyết thống cha- con), nhận dạng các dấu vết (vết máu, nước bọt, vết tinh dịch), xác định kẻ phạm tội trong các vụ án…. Đặc biệt, trong thảm hoạ, khi mà số lượng người chết và mất tích nhiều, các phần thi thể không còn nguyên vẹn, công tác nhận dạng trở nên hết sức khó khăn, phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và tiền của.

Nhận dạng cá thể là bước đầu tiên của quá trình giám định pháp y nhằm xác định chính xác cá thể trước khi tiến hành giám định các thương tổn. Trong nhận dạng người ta thường áp dụng các phương pháp khác nhau từ đơn giản đến phức tạp, từ những phương pháp truyền thống có quá trình lịch sử lâu dài đến các phương pháp mới được áp dụng gần đây. Trong đó phương pháp nhận dạng cá thể bằng hình thái học đã được các nhà khoa học ứng dụng từ những thế kỷ trước. Phương pháp này căn cứ vào các đặc điểm hình thái của con người, đặc biệt là hình thái khuôn mặt đã được phân loại và mô tả chi tiết như đặc điểm mắt, mũi, mồm, tai, các đặc điểm và kích thước xương sọ, các xương dài, các đặc điểm về răng, vân da…để phục vụ cho công tác nhận dạng. Ngày nay, nhận dạng cá thể bằng phương pháp hình thái học không ngừng được hoàn thiện và được ứng dụng khá rộng rãi đem lại hiệu quả thiết thực trong lĩnh vực pháp y hình sự.

Từ hơn hai thập niên gần đây các nhà khoa học trên thế giới đã áp dụng phương pháp nhận dạng người bằng kỹ thuật phân tích ADN. Đây là một phương pháp nhận dạng tiên tiến, có đô chính xác rất cao do nó đi sâu vào cấu trúc phân tử của vật chất di truyền – ADN. Mặt khác, phương pháp này có độ tin cậy cao được áp dụng với các mẫu sinh phẩm không nguyên vẹn, số lượng ít, chất lượng bị suy giảm – mà các phương pháp hình thái học không thể thực hiên được.

Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu nhận dạng cá thể bằng phương pháp hình thái học như Gerasimov, Pakov, Terzier, Rathbun, Buikstra, Pierre, Lee, Ceccaldi, Olivier, Simonin, Friederman, Prokop, Prietz….Theo thời gian, các nghiên cứu này ngày càng hoàn thiên, có độ tin cậy cao hơn và được ứng dụng rộng rãi hơn. Về lĩnh vực ADN trong nhận dạng cũng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Các hãng sản xuất như Promega, Perkin Elmer đã cho ra đời các kit xét nghiêm ADN bộ 3, 4, 6, 9, 16 locus… sử dụng trong nhận dạng với khả năng phân biệt và xác định cá thể rất cao. Tuy nhiên, về trình tự mồi, chế tạo thang allele, tỷ lệ các thành phần trong phản ứng PCR phức hợp… là những bí quyết công nghệ mà hãng không công bố. Điều đó dẫn đến việc khó khăn trong nghiên cứu, phát triển công nghệ, triển khai rộng rãi và đặc biệt phải phụ thuộc vào bộ kit và trang thiết của các hãng sản xuất.

Ở Việt Nam, nghiên cứu và áp dụng các phương pháp nhận dạng cá thể được một số tác giả quan tâm như Vũ Ngọc Thụ, Nguyễn Trọng Toàn, Phạm Hữu Phủng, Trần Đăng Truyền, Lê Gia Vinh, Lê Việt Vùng, Phạm Văn Phùng … Tuy nhiên các công trình nghiên cứu về nhận dạng cá thể người Việt Nam bằng hình thái học còn ít, các tác giả chỉ chủ yếu nghiên cứu một loại hình phục vụ cho công tác nhận dạng cá thể đơn lẻ và chưa thực sự trở thành hệ thống trong nhận dạng pháp y. Với giám định nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật ADN đã được tiến hành từ năm 1999 ở Viện Khoa học hình sự – Bộ Công an với các bộ kit và trang thiết bị nhập ngoại đồng bộ. Một số nghiên cứu của các tác giả như Lê Đình Lương, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoài Giang „.về các locus ADN đa hình (như D1S80, D17S5, FES,

F13A01…) sử dụng trong nhận dạng cá thể người, các tác giả Nghiêm Xuân Dũng, Ngô Tiến Quý, Trần Minh Đôn, Lương Thị Yến …đã nghiên cứu xây dựng thang allele và khảo sát tần suất phân bố allele locus TPOX, D13S317, D5S818 và D7S820 người Việt Nam; Hổ Quang Huy, Lê Viết Việt đã nghiên cứu xây dựng thang allele locus VWA, khảo sát tần suất locus D5S818, D7S820, D13S317 và VWA ở người Mường Việt Nam ứng dụng trong nhận dạng cá thể người. Việc nghiên cứu sản xuất thang allele, tối ưu điều kiện phản ứng PCR phức hợp, khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 và D16S539 ở người Việt (Kinh) chưa được tác giả nào công bố.

Đứng trước thực tiễn giám định nhận dạng tại Việt Nam ngày một khó khăn phức tạp về cả số lượng cá thể cần nhận dạng lẫn quy mô giám định khi các trường hợp hoả hoạn, tai nạn (đường bộ, đường thuỷ, đường hàng không.), thiên tai (lũ lụt, bão, lốc, lở đất.) xảy ra ngày một tăng, ngoài việc đào tạo đội ngũ giám định viên đông đảo về số lượng, đảm bảo về chất lượng và các cơ sở giám định pháp y có đầy đủ các trang thiết bị thì vấn đề xây dựng và hoàn thiện các phương pháp giám định nhận dạng là vô cùng cần thiết.

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với mục tiêu sau đây:

1. Đánh giá hiệu quả nhân dạng cá thể bằng phương pháp hình thái học.

2. Tối ưu hoá thành phần phản ứng PCR đơn, PCR phức, tạo thang allele và khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 và D16S539 ở người Việt (Kinh) sử dụng trong nhân dạng cá thể.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình

ĐẢT VẤN ĐỂ t

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIÊU 4

1.1. Nhận dạng cá thể trong giám định pháp y 4

1.2. Một số phương pháp nhận dạng cá thể ngưòi trong pháp y 6

1.2.1. Phương pháp hình thái học 6

1.2.2. Nhân dạng cá thể bằng các yêu tố nhóm có bản chất protein 11

1.2.3. Nhân dạng cá thể người bằng phân tích ADN nhân 12

1.2.4. Phương pháp phân tích ADN ty thể 16

13. Kỹ thuật PCR trong nhận dạng cá thể 18

1.3.1. Kỹ thuật PCR 18

1.3.2. Điện di phân tách ADN 21

1.3.3. Chế tạo thang allele 22

1.3.4. Phát hiện băng ADN sau điện di 23

1.4. Đại cương về locus ADN sử dụng trong nhận dạng cá thể 24

1.4.1. Khái niệm các đoạn lặp và STR 24

1.4.2. Danh pháp đối với chỉ thị ADN (DNA marker) 27

1.4.3. Locus STR sử dụng trong nhận dạng cá thể người 27

1.5. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 29

1.5.1. Tình hình nghiên cứu công tác nhận dạng cá thể người bằng

phương pháp hình thái học 29

1.5.2.Tình hình nghiên cứu nhân dạng cá thể người bằng phương

pháp phân tích ADN 30

CHƯƠNG 2: Đối TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 33

2.1. Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu phương pháp giám đinh nhân dạng 33

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu một số locus STR ở người Việt 33

2.1.3. Thiêt bi nghiên cứu 33

2.1.4. Hoá chất 33

2.2. Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1. Phương pháp nhân dạng cá thể người 35

2.2.2. Nghiên cứu một số locus STR ở người Việt 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 51

3.1. Kết quả nghiên cứu các phương pháp giám định nhận dạng 51

3.1.1. Tỷ lệ áp dụng phương pháp giám đinh nhân dạng hình thái

học, phân tích ADN và kêt hợp hình thái – ADN 51

3.1.2. Tỷ lệ áp dụng các phương pháp hình thái học trong giám đinh

nhân dạng pháp y 51

3.1.3. Kêt quả giám đinh của các phương pháp nhân dạng 52

3.1.4. Giám đinh nhân dạng qua khám nghiệm pháp y 53

3.1.5. Nhân dạng cá thể bằng phương pháp lổng ảnh 55

3.1.6. Nhân dạng cá thể qua các đặc điểm mô tả 56

3.1.7. Nhân dạng cá thể bằng phương pháp vân da 58

3.1.8. Nhân dạng cá thể bằng phương pháp phân tích ADN 59

3.2. Nghiên cứu hai locus TH01 và D16S539 sử dụng trong nhận

dạng cá thể 60

3.2.1. Kêt quả tối ưu hóa thành phần và điều kiện PCR đơn locus

TH01 và D16S539 60

3.2.2. Kêt quả tối ưu hoá thành phần và điều kiên PCR phức hợp hai

locus TH01 – D16S539 65

3.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo thang allele chỉ thị của 2 locus

TH01 và D16S539 69

3.3.1. Chế tạo thang allele bằng phương pháp trôn mẫu 69

3.3.2. Chế tạo thang allele bằng phương pháp PCR 70

3.3.3. Kêt quả xác đinh allele trong thang allele bằng phương pháp

giải trình tự 71

3.3.4. So sánh kêt quả phân tích allele của các mẫu xét nghiêm theo

phương pháp của chúng tôi với bô kit của hãng Promega 73

3.4. Kết quả khảo sát tần suất phân bố allele một số locus STR

ngưòi Việt (Kinh) 74

3.4.1. Kêt quả khảo sát tần suất phân bố allele của locus TH01

người Việt 74

3.4.2. Kêt quả khảo sát tần suất phân bố allele locus D16S539

người Việt 78

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 82

4.1. Các phương pháp giám định nhận dạng 82

4.1.1. Đặc điểm của mẫu giám đinh nhân dạng trong pháp y 82

4.1.2. Nhân dạng thông qua khám nghiệm hình thái 84

4.1.3. Nhân dạng bằng phương pháp lổng ảnh 86

4.1.4. Nhân dạng cá thể thông qua đặc điểm mô tả 88

4.1.5. Nhân dạng bằng phương pháp vân da 89

4.1.6. Nhân dạng bằng phương pháp phân tích ADN 90

4.2. Tối ưu các thành phần và điều kiện phản ứng PCR đơn locus

D16S539 và THol 92

4.2.1. Tối ưu nổng đô dNTPs cho phản ứng PCR môt locus 92

4.2.2. Tối ưu nổng đô MgCl2 cho PCR môt locus 93

4.2.3. Tối ưu enzym TaqDNA polymerase cho PCR một locus 94

4.2.4. Tối ưu nồng độ mồi cho PCR một locus 95

4.2.5. Tối ưu hàm lượng ADN khuôn cho PCR một locus 95

4.2.6. Tối ưu điều kiên nhiệt độ gắn mồi 97

43. Tối ưu hoá thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR phức

hợp 2 locus TH01 – D16S539 98

4.3.1. Tối ưu hoá dNTP cho PCR phức 2 locus TH01 – D16S539 99

4.3.2. Tối ưu nồng độ MgCl2 cho PCR phức 2 locus 100

4.3.3. Tối ưu nồng độ dung dịch đệm (buffer) cho PCR 101

phức hợp 2 locus

4.3.4. Tối ưu Taq DNA polymerase cho PCR phức 2 locus 101

4.3.5. Tối ưu hàm lượng mồi cho PCR phức 2 locus 101

4.3.6. Tối ưu hàm lượng ADN khuôn cho PCR 2 locus 102

4.4. Tạo thang chỉ thị các allele locus TH01 và D16S539 103

4.4.1. Thu thập các allele của locus TH01 và D16S539 103

4.4.2. Tạo thang allele của locus TH01 và D16S539

bằng phương pháp trộn sản phẩm PCR 105

4.4.3. Chế tạo thang allele cho locus TH01 và D16S539

bằng phương pháp PCR 107

4.4.4. Đánh số allele trong thang theo quy chuẩn của quốc tế 108

4.5. Khảo sát tần suất phân bố allele TH01 và D16S539 ngưòi Việt 109

4.5.1. Kết quả khảo sát tần suất phân bố allele của locus TH01 109

4.5.2. Kết quả khảo sát tần suất phân bố allele của locus D16S539 113

KẾT LUẬN 117

KIẾN NGHỊ 119

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN cúu ĐÃ CÔNG Bố CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐEN LUẬN ÁN 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

PHỤ LỤC 136