Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tốn thương giác mạc

Tốn thương giác mạc là một bệnh lý thường gặp trong nhãn khoa. Nguyên nhân gây tốn thương giác mạc rất khác nhau nhưng đều làm mất độ trong của giác mạc và gây giảm thị lực ở nhiều mức độ khác nhau. Trong một số trường hợp, vùng rìa giác mạc – nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô giác mạc cũng bị tốn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân là hội chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc. Hậu quả của hội chứng này làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt của giác mạc, loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46]. Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc, các nhà nhãn khoa đã sử dụng các phương pháp khác nhau: Ghép kết mạc rìa tự thân, ghép giác – củng mạc rìa từ giác mạc tử thi, ghép màng ối. Kết quả điều trị khá tốt, đặc biệt với những trường hợp tốn thương một mắt. Tuy nhiên với các kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép lấy từ bên mắt lành hoặc từ mắt tử thi cần có một diện tích khá lớn hoặc cần toàn bộ giác mạc.

Trong vài năm gần đây, y – sinh học hiện đại đã đạt được những thành tựu lớn trong việc đối mới mô bằng ghép tế bào gốc. Trong nhãn khoa, công nghệ tạo tấm biểu mô giác mạc từ việc nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc trên thực nghiệm và trên người đã có những thành công nhất định. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy mang lại hiệu quả tốt cho việc phục hồi cấu trúc và chức năng của giác mạc.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong nước, nhiều bệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cần được điều trị và với mong muốn đưa ra được một phương pháp hiện đại điều trị hội chứng này, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tốn thương giác mạc”.

Mục tiêu của đề tài là:

1. Xây dựng qui trình nuôi cấy, nhận dạng tế bào gốc biểu mô vùng rìa giác mạc thỏ trên nền màng ối người, tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Ghép thành công tấm biểu mô nuôi cấy trên mắt thỏ.

2. Tạo tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy, phục vụ ghép tự thân cho một số bệnh nhân tổn thương giác mạc.

Mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm giá đỡ cho tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từ tế bào gốc biểu mô vùng rìa.

2. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy.

3. Tạo mô hình thực nghiệm gây tổn thương khu trú giác mạc thỏ. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Xây dụng các tiêu chuẩn đánh giá về hiệu quả ghép trên mắt thỏ.

4. Bước đầu tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tự thân cho một số bệnh nhân tổn thương giác mạc.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2] 3

1.1.1. Giác mạc 3

1.1.3. Kết mạc nhãn cầu 4

1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc 5

1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36] 8

1.2. Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy 10

1.2.1. Màng ối 10

1.2.2. Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy 12

1.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc 14

1.3.1. Chuẩn bị mẫu mô vùng rìa để nuôi cấy 14

1.3.2. Môi trường nuôi cấy 15

1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM 16

1.3.4. Định danh tế bào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17

1.4. Điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17

1.4.1. Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [24, 42, 46, 48] 17

1.4.2. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 18

1.4.3. Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 19

1.4.4. Phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM[17] 19

1.4.5. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM bằng ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1. Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Mô hình nghiên cứu 23

2.3. Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 24

2.3.2. Xây dựng qui trình trích thủ và xử lý mẫu vùng rìa giác mạc 25

2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 27

2.3.4. Ghép thực nghiệm trên thỏ 27

2.3.5. Ghép trên bệnh nhân tình nguyện 30

2.4. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33

2.5. Địa điểm nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 35

3.1.1. Lựa chọn màng ối 35

3.1.2. Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối: 37

3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh vùng rìa để nuôi cấy 39

3.2.1. Mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bị cho nuôi cấy 39

3.2.2. Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối 40

3.2.4. Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy 42

3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 44

3.4. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 45

3.4.1. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3) 45

3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mô 45

3.5. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy 47

3.5.1. Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 48

3.5.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 49

3.5.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 51

3.6. Mô hình gây bỏng cho thỏ 52

3.7. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 53

3.8. Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện 56

3.8.1. Đặc điểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4) 56

3.8.2. Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô (Bảng 3.5) 56

3.8.3. Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô (Bảng 3.6) 57

3.8.4. Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi (Bảng 3.7) 57

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 61

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71