Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng
Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng.Bề mặt nhãn cầu (BMNC) bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau như: bỏng mắt do hoá chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, nhiễm khuẩn mắt nặng, nhiều phẫu thuật thực hiện trên cùng một mắt, đeo kính tiếp xúc… Một trong những di chứng thường gặp khi tổn thương BMNC là hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (Limbal stem cell deficiency-LSCD). Hậu quả của hội chứng này là làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc cũng có thể gây ra hiện tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát, thậm chí có thể gây thủng giác mạc. Vì vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau [1],[2].
Để điều trị ngoại khoa hội chứng LSCD, các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc vùng rìa. Với phương pháp ghép kết mạc rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt lành phải khá lớn. Phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy được cho là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng trước đây. Quá trình nuôi cấy đã giảm thiểu số lượng tế bào không có chức năng bình thường, việc sinh thiết vùng rìa có thể nhắc lại nếu cần thiết, giảm nguy cơ thải loại mảnh ghép vì trong tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy không có mặt của tế bào Langerhans-tế bào đóng vai trò trình diện kháng nguyên. Phương pháp này đã được thực hiện tương đối phổ biến trên thế giới [3],[4],[5],[6]. Tuy nhiên, phương pháp này lại không thực hiện được ở các trường hợp bệnh nhân (BN) tổn thương cả hai mắt.
Đối với các trường hợp BN bị tổn thương BMNC cả hai mắt, trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép tế bào gốc dị thân từ mắt người thân trong gia đình hoặc từ vùng rìa giác mạc của người hiến. Tuy nhiên, những BN này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao [7], [8].
Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng (NMM) là loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý. Cả hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc phôi thai là ngoại bì da. Năm 2003, Nakamura T. và cộng sự (CS.) đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô NMM và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [2],[9]. Cũng tác giả này là người đầu tiên mô tả thành công việc ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy trên người bị LSCD [10]. Sau đó rất nhiều tác giả thông báo thực hiện thành công kỹ thuật này [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25].
Các nghiên cứu cho thấy hình dạng, kích thước và cấu trúc siêu vi của tế bào tấm biểu mô NMM nuôi cấy khá tương đồng với biểu mô giác mạc bình thường [26]. Như vậy, việc sử dụng tấm biểu mô NMM nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn tốt cho các BN bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa.
Với mong muốn áp dụng vào Việt Nam một phương pháp điều trị mới cho các BN bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng” nhằm mục tiêu sau đây:
1. Xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng và môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo tấm biểu mô.
2. Xác định phương pháp phù hợp để nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng
1. Dua H. S., Saini J. S., Azuara-Blanco A. et al (2000). Limbal stem cell deficiency: concept, aetiology, clinical presentation, diagnosis and management. Indian J Ophthalmol, 48(2), 83-92.
2. Nakamura T., Endo K., Cooper L. J. et al (2003). The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44(1), 106-116.
3. Koizumi N., Inatomi T., Suzuki T. et al (2001). Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology, 108(9), 1569-1574.
4. Nakamura T., Koizumi N., Tsuzuki M. et al (2003). Successful regrafting of cultivated corneal epithelium using amniotic membrane as a carrier in severe ocular surface disease. Cornea, 22(1), 70-71.
5. Sangwan V. S., Matalia H. P., Vemuganti G. K. et al (2006). Clinical outcome of autologous cultivated limbal epithelium transplantation. Indian J Ophthalmol, 54(1), 29-34.
6. Zakaria N., Possemiers T., Dhubhghaill S. N. et al (2014). Results of a phase I/II clinical trial: standardized, non-xenogenic, cultivated limbal stem cell transplantation. J Transl Med, 12, 58.
7. Holland E. J., Schwartz G. S. (2004). The Paton lecture: Ocular surface transplantation: 10 years’ experience. Cornea, 23(5), 425-431.
8. Samson C. M., Nduaguba C., Baltatzis S. et al (2002). Limbal stem cell transplantation in chronic inflammatory eye disease. Ophthalmology, 109(5), 862-868.
9. Nakamura T., Kinoshita S. (2003). Ocular surface reconstruction using cultivated mucosal epithelial stem cells. Cornea, 22(7 Suppl), S75-80.
10. Nakamura T., Inatomi T., Sotozono C. et al (2004). Transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial cells in patients with severe ocular surface disorders. Br J Ophthalmol, 88(10), 1280-1284.
11. Nishida K., Yamato M., Hayashida Y. et al (2004). Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med, 351(12), 1187-1196.
12. Ang L. P., Nakamura T., Inatomi T. et al (2006). Autologous serum- derived cultivated oral epithelial transplants for severe ocular surface disease. Arch Ophthalmol, 124(11), 1543-1551.
13. Inatomi T., Nakamura T., Kojyo M. et al (2006). Ocular surface
reconstruction with combination of cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation and penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol, 142(5), 757-764.
14. Ma D. H., Kuo M. T., Tsai Y. J. et al (2009). Transplantation of cultivated oral mucosal epithelial cells for severe corneal burn. Eye (Lond), 23(6), 1442-1450.
15. Uchino Y., Uchino M., Shimazaki J. (2009). Combination treatment of intravenous immunoglobulin and cultivated oral mucosal epithelial transplantation for ocular cicatricial pemphigoid. BMJ Case Rep, 2009.
16. Chen H. C., Chen H. L., Lai J. Y. et al (2009). Persistence of transplanted oral mucosal epithelial cells in human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci, 50 (10), 4660-4668.
17. Nakamura T., Takeda K., Inatomi T. et al (2011). Long-term results of autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation in the scar phase of severe ocular surface disorders. Br J Ophthalmol, 95(7), 942-946.
18. Satake Y., Higa K., Tsubota K. et al (2011). Long-term outcome of cultivated oral mucosal epithelial sheet transplantation in treatment of total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology, 118(8), 1524-1530.
19. Takeda K., Nakamura T., Inatomi T. et al (2011). Ocular surface reconstruction using the combination of autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation and eyelid surgery for severe ocular surface disease. Am J Ophthalmol, 152(2), 195-201 e191.
20. Hirayama M., Satake Y., Higa K. et al (2012). Transplantation of
cultivated oral mucosal epithelium prepared in fibrin-coated culture dishes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(3), 1602-1609.
21. Burillon C., Huot L., Justin V. et al (2012). Cultured autologous oral
mucosal epithelial cell sheet (CAOMECS) transplantation for the treatment of corneal limbal epithelial stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(3), 1325-1331.
22. Sotozono C., Inatomi T., Nakamura T. et al (2013). Visual improvement after cultivated oral mucosal epithelial transplantation. Ophthalmology, 120(1), 193-200.
23. Sangwan V. S., Jain R., Basu S. et al (2014). Transforming ocular surface stem cell research into successful clinical practice. Indian J Ophthalmol, 62(1), 29-40.
24. Kocaba V., Thépot A., Yamato M. et al (2014). Long-Term Results of Cultured Autologous Oral Mucosa Epithelial CellSheet (CAOMECS) Graft for the Treatment of Blindness Due to Bilateral Limbal Stem Cell Deficiency. J Stem Cell Res Ther, 4(3), 181.
25. Kolli S., Ahmad S., Mudhar H. S. et al (2014). Successful application of ex vivo expanded human autologous oral mucosal epithelium for the treatment of total bilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells, 32, 2135-2146.
26. Madhira S. L., Vemuganti G., Bhaduri A. et al (2008). Culture and characterization of oral mucosal epithelial cells on human amniotic membrane for ocular surface reconstruction. Mol Vis, 14, 189-196.
27. Trịnh Bình (2009). Nhận diện tế bào gốc biểu mô giác mạc. Tạp chí nghiên cứu y học, 64 (5), 111-118.
28. Davanger M., Evensen A. (1971). Role of the pericorneal papillary structure in renewal of corneal epithelium. Nature, 229(5286), 560-561.
29. Tseng S. C., Tsubota K. (1997). Important concepts for treating ocular surface and tear disorders. Am J Ophthalmol, 124(6), 825-835.
30. Moharamzadeh K., Brook I. M., Van Noort R. et al (2007). Tissue- engineered oral mucosa: a review of the scientific literature. JDent Res, 86(2), 115-124.
31. Ian R. Freshney (2002). Human oral epithelium. Culture of epithelial cells, second edition, Wiley-Liss, Scotland, 196-214.
32. Mehrel T., Hohl D., Rothnagel J. A. et al (1990). Identification of a major keratinocyte cell envelope protein, loricrin. Cell, 61 (6), 1103-1112.
33. Smith (2012). Oral mucosa. Histology 1121 2012 [cited 2014 19 – 12];
Available from: <https://www.studyblue.com/notes/note/n7oral-
mucosa/deck/2612213>.
34. Jabero M. F. (2010). Investigation for the identification of transient amplifying/stem cell pool in oral mucosa, Master of science, The Ohio State University.
35. Mackenzie I. C. (2005). Stem cells in oral mucosal epithelia. Oral biosci med 2(3), 95-103.
36. Dabelsteen E. (2005). Keeping faces-Saving/maintenance of oral mucosa and salivary glands. Oral biosci med, 2(2/3), 91-94.
37. Dotto G. P. (1999). Signal transduction pathways controlling the switch between keratinocyte growth and differentiation. Crit Rev Oral Biol Med, 10(4), 442-457.
38. Hatfield S. D., Shcherbata H. R., Fischer K. A. et al (2005). Stem cell division is regulated by the microRNA pathway. Nature, 435(7044), 974-978.
39. Ian R. Freshney (2002). Cell interaction and epithelial differentiation. Culture of epithelial cells, second edition, Wiley-Liss, Scotland, 31-39.
40. Okazaki M., Yoshimura K., Suzuki Y. et al (2003). Effects of subepithelial fibroblasts on epithelial differentiation in human skin and oral mucosa: heterotypically recombined organotypic culture model. Plast Reconstr Surg, 112(3), 784-792.
41. Merne M., Syrjanen S. (2003). The mesenchymal substrate influences the epithelial phenotype in a three-dimensional cell culture. Arch Dermatol Res, 295(5), 190-198.
42. Florin L., Maas-Szabowski N., Werner S. et al (2005). Increased keratinocyte proliferation by JUN-dependent expression of PTN and SDF-1 in fibroblasts. J Cell Sci, 118(Pt 9), 1981-1989.
43. Thoft R. A. (1989). The role of the limbus in ocular surface maintenance and repair. Acta Ophthalmol Suppl, 192, 91-94.
44. Sangwan V. S., Tseng S. C. (2001). New perspectives in ocular surface disorders. An integrated approach for diagnosis and management. Indian J Ophthalmol, 49(3), 153-168.
45. Pellegrini G., Traverso C. E., Franzi A. T. et al (1997). Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet, 349(9057), 990-993.
46. Homma R., Yoshikawa H., Takeno M. et al (2004). Induction of epithelial progenitors in vitro from mouse embryonic stem cells and application for reconstruction of damaged cornea in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45(12), 4320-4326.
47. Izumi K., Takacs G., Terashi H. et al (1999). Ex vivo development of a composite human oral mucosal equivalent. J Oral Maxillofac Surg, 57(5), 571-577; discussion 577-578.
48. Izumi K., Terashi H., Marcelo C. L. et al (2000). Development and characterization of a tissue-engineered human oral mucosa equivalent produced in a serum-free culture system. J Dent Res, 79(3), 798-805.
49. Yoshizawa M., Feinberg S. E., Marcelo C. L. et al (2004). Ex vivo produced human conjunctiva and oral mucosa equivalents grown in a serum-free culture system. J Oral Maxillofac Surg, 62(8), 980-988.
50. Fukuda K., Chikama T., Nakamura M. et al (1999). Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea, and conjunctiva. Cornea, 18(1), 73-79.
51. Mejia L. F., Acosta C., Santamaría J. P. (2000). Use of nonpreserved human amniotic membrane for the reconstruction of the ocular surface. Cornea, 19(3), 288-291.
52. Prabhasawat P., Tesavibul N., Komolsuradej W. (2001). Single and multilayer amniotic membrane transplantation for persistent corneal epithelial defect with and without stromal thinning and perforation. Br J Ophthalmol, 85(12), 1455-1463.
53. Dua H. S., Azuara-Blanco A. (1999). Amniotic membrane transplantation. Br J Ophthalmol, 83(6), 748-752.
54. Lee S. H., Tseng S. C. (1997). Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. Am J Ophthalmol, 123(3), 303-312.
55. Purdue G. F. (1997). Dermagraft-TC pivotal efficacy and safety study. JBurn Care Rehabil, 18(1 Pt 2), S13-14.
56. Itabashi Y., Miyoshi S., Kawaguchi H. et al (2005). A new method for manufacturing cardiac cell sheets using fibrin-coated dishes and its electrophysiological studies by optical mapping. Artif Organs, 29(2), 95-103.
57. Higa K., Shimmura S., Kato N. et al (2007). Proliferation and differentiation of transplantable rabbit epithelial sheets engineered with or without an amniotic membrane carrier. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48(2), 597-604.
58. Nishida K., Yamato M., Hayashida Y. et al (2004). Functional bioengineered corneal epithelial sheet grafts from corneal stem cells expanded ex vivo on a temperature-responsive cell culture surface. Transplantation, 77(3), 379-385.
59. Shimizu T., Yamato M., Isoi Y. et al (2002). Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surfaces. Circ Res, 90(3), e40.
60. Shimazaki J., Higa K., Kato N. et al (2009). Barrier function of cultivated limbal and oral mucosal epithelial cell sheets. Invest Ophthalmol Vis Sci, 50(12), 5672-5680.
61. Utheim T. P. (2015). Concise review: transplantation of cultured oral mucosal epithelial cells for treating limbal stem cell deficiency-current status and future perspectives. Stem Cells, 33(6), 1685-1695.
62. Shortt A. J., Secker G. A., Notara M. D. et al (2007). Transplantation of ex vivo cultured limbal epithelial stem cells: a review of techniques and clinical results. Surv Ophthalmol, 52(5), 483-502.
63. Inatomi T., Nakamura T., Koizumi N. et al (2006). Midterm results on ocular surface reconstruction using cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation. Am J Ophthalmol, 141(2), 267-275.
64. Chen H. C., Yeh L. K., Tsai Y. J. et al (2012). Expression of angiogenesis-related factors in human corneas after cultivated oral mucosal epithelial transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(9), 5615-5623.
65. Krishnan S., Iyer G. K., Krishnakumar S. (2010). Culture & characterisation of limbal epithelial cells & oral mucosal cells. Indian J Med Res, 131, 422-428.
66. Hashemi H., Salehnia M., Kamali M. et al (2009). The histological characteristics of cultured oral epithelium in different culture conditions. Iran Biomed J, 13(2), 109-115.
67. Priya C. G., Arpitha P., Vaishali S. et al (2011). Adult human buccal
epithelial stem cells: identification, ex-vivo expansion, and
transplantation for corneal surface reconstruction. Eye (Lond), 25(12), 1641-1649.
68. Sen S., Sharma S., Gupta A. et al (2011). Molecular characterization of explant cultured human oral mucosal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 52(13), 9548-9554.
69. Hori Y., Nishida K., Yamato M. et al (2008). Differential expression of MUC16 in human oral mucosal epithelium and cultivated epithelial sheets. Exp Eye Res, 87(3), 191-196.
70. Hori Y., Sugiyama H., Soma T. et al (2007). Expression of membrane- associated mucins in cultivated human oral mucosal epithelial cells. Cornea, 26(9 Suppl 1), S65-69.
71. Oie Y., Hayashi R., Takagi R. et al (2010). A novel method of culturing human oral mucosal epithelial cell sheet using post-mitotic human dermal fibroblast feeder cells and modified keratinocyte culture medium for ocular surface reconstruction. Br J Ophthalmol, 94(9), 1244-1250.
72. Satake Y., Dogrn M., Yamane G. Y. et al (2008). Barrier function and cytologic features of the ocular surface epithelium after autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation. Arch Ophthalmol, 126(1), 23-28.
73. Hayashida Y., Nishida K., Yamato M. et al (2005). Ocular surface reconstruction using autologous rabbit oral mucosal epithelial sheets fabricated ex vivo on a temperature-responsive culture surface. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46(5), 1632-1639.
74. Ilmarinen T., Laine J., Juuti-Uusitalo K. et al (2013). Towards a defined, serum- and feeder-free culture of stratified human oral mucosal epithelium for ocular surface reconstruction. Acta Ophthalmol, 91(8), 744-750.
75. Sotozono C., Inatomi T., Nakamura T. et al (2014). Cultivated oral mucosal epithelial transplantation for persistent epithelial defect in severe ocular surface diseases with acute inflammatory activity. Acta Ophthalmol, 92(6), e447-453.
76. Rheinwald J. G. (1980). Serial cultivation of normal human epidermal keratinocytes. Methods Cell Biol, 21A, 229-254.
77. Macpherson I., Bryden A. (1971). Mitomycin C treated cells as feeders. Exp Cell Res, 69(1), 240-241.
78. (Food and Drug Administration (FDA) centre for biologics evaluation and research (CBER) (2000). “In information for recommendations for physicians involved in the co-culture of human embryos with non-human animal cells. US (FDA report).
79. Martin M. J., Muotri A., Gage F. et al (2005). Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med, 11(2), 228-232.
80. Ilmarinen T., Laine J., Juuti-Uusitalo K. et al (2013). Towards a defined, serum- and feeder-free culture of stratified human oral mucosal epithelium for ocular surface reconstruction. Acta Ophthalmol, 91, 744-750.
81. Barnes D., Sato G. (1980). Methods for growth of cultured cells in serum-free medium. Analy Bioc, 102, 255-270.
82. Green H. (1978). Cyclic AMP in relation to proliferation of the epidermal cell: a new view. Cell, 15(3), 801-811.
83. Nakamura T., Inatomi T., Sotozono C. et al (2006). Transplantation of autologous serum-derived cultivated corneal epithelial equivalents for the treatment of severe ocular surface disease. Ophthalmology, 113(10), 1765-1772.
84. Hayashi I., Sato G. H. (1976). Replacement of serum by hormones permits growth of cells in a defined medium. Nature, 259(5539), 132-134.
85. Ulltveit-Moe HF E. J., Bjorkblom B., Moller S.G. et al (2011).
Xenobiotic- and Serum-Free Culture Protocol for Autologous Cultivated Oral Mucosal Epithelial Cells on Therapeutic Contact Lenses. Investigative Ophthalmology and Visual Science, Poster Abstract.
86. Đỗ Thùy Hương (2010). So sánh kết quả tạo tấm biểu mô giác mạc thỏ từ tế bào gốc biểu mô vùng rìa bằng mảnh mô và dịch treo, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú, Trường đại học Y Hà Nội.
87. Nguyễn Phúc Hoàn (2011). Nghiên cứu tạo tấm biểu mô bằng nuôi cấy tế bào gốc biểu mô kết mạc thỏ, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú, Trường đại học Y Hà Nội.
88. Izumi K., Tobita T., Feinberg S. E. (2007). Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. JDent Res, 86(4), 341-346.
89. Barrandon Y., Green H. (1987). Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A, 84(8), 2302-2306.
90. Nakamura T., Takeda K., Inatomi T. et al (2010). Long-term results of autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation in the scar phase of severe ocular surface disorders. Br J Ophthalmol, 95(7), 942-946.
91. Iida T., Takami Y., Yamaguchi R. et al (2005). Development of a tissue-engineered human oral mucosa equivalent based on an acellular allogeneic dermal matrix: a preliminary report of clinical application to burn wounds. Scand JPlast Reconstr Surg Hand Surg, 39(3), 138-146.
92. Bhargava S., Chapple C. R. (2004). Buccal mucosal urethroplasty: is it the new gold standard? BJUInt, 93(9), 1191-1193.
93. Quint E. H., Park J. M. (2014). Promising surgical innovations involving buccal mucosa for vaginal creation and reconstruction. Obstet Gynecol, 123(5), 921-922.
94. Kim M. K., Lee J. L., Oh J. Y. et al (2008). Efficient cultivation conditions for human limbal epithelial cells. J Korean Med Sci, 23(5), 864-869.
95. Lim L. S., Riau A., Poh R. et al (2009). Effect of dispase denudation on amniotic membrane. Mol Vis, 15, 1962-1970.
96. Nakamura T., Yoshitani M., Rigby H. et al (2004). Sterilized, freeze- dried amniotic membrane: a useful substrate for ocular surface reconstruction. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45(1), 93-99.
97. Hopkinson A., Shanmuganathan V. A., Gray T. et al (2008). Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods, 14(4), 371-381.
98. Koizumi N., Rigby H., Fullwood N. J. et al (2007). Comparison of intact and denuded amniotic membrane as a substrate for cell- suspension culture of human limbal epithelial cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 245(1), 123-134.
99. Đỗ Thùy Hương, Nguyễn Thị Bình (2009). Nghiên cứu phương pháp nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc. Nghiên cứu y học, 65(6), 7-10.
100. Nguyễn Phúc Hoàn, Nguyễn Khang Sơn, Nguyễn Thị Bình et al. (2013). Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô kết mạc từ tế bào gốc kết mạc thỏ. Tạp chíy dược học quân sự, 38(4), 23-27.
101. Krishnan S., Sudha B., Krishnakumar S. (2010). Isoforms of p63 in corneal stem cells cultured on human amniotic membrane. Biologicals, 38(5), 570-576.
102. Pellegrini G., Golisano O., Paterna P. et al (1999). Location and clonal analysis of stem cells and their differentiated progeny in the human ocular surface. J Cell Biol, 145(4), 769-782.
103. Kawasaki S., Tanioka H., Yamasaki K. et al (2006). Expression and tissue distribution of p63 isoforms in human ocular surface epithelia. Exp Eye Res, 82(2), 293-299.
104. Szurman P., Warga M., Grisanti S. et al (2006). Sutureless amniotic membrane fixation using fibrin glue for ocular surface reconstruction in a rabbit model. Cornea, 25(4), 460-466.
105. Hanada K., Shimazaki J., Shimmura S. et al (2001). Multilayered amniotic membrane transplantation for severe ulceration of the cornea and sclera. Am J Ophthalmol, 131(3), 324-331.
106. Solomon A., Pires R. T., Tseng S. C. (2001). Amniotic membrane transplantation after extensive removal of primary and recurrent pterygia. Ophthalmology, 108(3), 449-460.
107. Sudha B., Jasty S., Krishnan S. et al (2009). Signal transduction pathway involved in the ex vivo expansion of limbal epithelial cells cultured on various substrates. Indian JMed Res, 129(4), 382-389.
108. Grueterich M., Espana E., Tseng S. C. (2002). Connexin 43 expression and proliferation of human limbal epithelium on intact and denuded amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci, 43(1), 63-71.
109. Meller D., Pires R. T., Tseng S. C. (2002). Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol, 86(4), 463-471.
110. Squier C. A., Kremer M. J. (2001). Biology of oral mucosa and esophagus. J Natl Cancer Inst Monogr, 29, 7-15.
111. Dua H. S., Joseph A., Shanmuganathan V. A. et al (2003). Stem cell differentiation and the effects of deficiency. Eye (Lond), 17(8), 877-885.
112. Inatomi T., Nakamura T., Koizumi N. et al (2005). Current concepts and challenges in ocular surface reconstruction using cultivated mucosal epithelial transplantation. Cornea, 24(8 Suppl), S32-S38.
113. Atallah M. R., Palioura S., Perez V. L. et al (2016). Limbal stem cell transplantation: current perspectives. Clin Ophthalmol, 10, 593-602.
114. Nakamura T., Inatomi T., Sotozono C. et al (2004). Successful primary culture and autologous transplantation of corneal limbal epithelial cells from minimal biopsy for unilateral severe ocular surface disease. Acta Ophthalmol Scand, 82(4), 468-471.
115. Sangwan V. S., Matalia H. P., Vemuganti G. K. et al (2005). Early results of penetrating keratoplasty after cultivated limbal epithelium transplantation. Arch Ophthalmol, 123(3), 334-340.
116. Abe R., Shimizu T., Shibaki A. et al (2003). Toxic epidermal necrolysis and Stevens-Johnson syndrome are induced by soluble Fas ligand. Am J Pathol, 162(5), 1515-1520.
117. Atiyeh B. S., Costagliola M. (2007). Cultured epithelial autograft (CEA) in burn treatment: three decades later. Burns, 33(4), 405-413.
118. Kanayama S., Nishida K., Yamato M. et al (2007). Analysis of angiogenesis induced by cultured corneal and oral mucosal epithelial cell sheets in vitro. Exp Eye Res, 85(6), 772-781.
119. Yiu S. C., Thomas P. B., Nguyen P. (2007). Ocular surface reconstruction: recent advances and future outlook. Curr Opin Ophthalmol, 18 (6), 509-514.
120. Nakamura T., Inatomi T., Cooper L. J. et al (2007). Phenotypic investigation of human eyes with transplanted autologous cultivated oral mucosal epithelial sheets for severe ocular surface diseases. Ophthalmology, 114(6), 1080-1088.
121. Gaddipati S., Muralidhar R., Sangwan V. S. et al (2014). Oral epithelial cells transplanted on to corneal surface tend to adapt to the ocular phenotype. Indian J Ophthalmol, 62(5), 644-648.
122. Bardor M., Nguyen D. H., Diaz S. et al (2005). Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem, 280(6), 4228-4237.
123. Ang L. P., Tanioka H., Kawasaki S. et al (2010). Cultivated human conjunctival epithelial transplantation for total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci, 51(2), 758-764.
124. Sekiyama E., Nakamura T., Kawasaki S. et al (2006). Different expression of angiogenesis-related factors between human cultivated corneal and oral epithelial sheets. Exp Eye Res, 83(4), 741-746.
ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu 3
1.1.1. Giác mạc 3
1.1.2. Kết mạc 5
1.1.3. Vùng rìa củng-giác mạc 5
1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC 6
1.1.4.1. Mi mắt 6
1.1.4.2. Phim nước mắt 6
1.1.4.3. Các tuyến lệ 6
1.1.4.4. Sự toàn vẹn của hai cung phản xạ điều tiết nước mắt 7
1.1.4.5. Chức năng của tế bào biểu mô BMNC được hỗ trợ bởi nguyên
bào sợi nhu mô và chất cơ bản 7
1.2. Cấu trúc biểu mô bề mặt khoang miệng 7
1.3. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc 12
1.3.1. Nguyên nhân 12
1.3.2. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa 12
1.3.3. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc .. 13
1.4. Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô NMM 15
1.4.1. Các loại nền nuôi cấy tế bào 15
1.4.2. Chuẩn bị mẫu mô NMM và xử lý miếng mô cho nuôi cấy 19
1.4.3. Môi trường nuôi cấy 26
1.4.4. Định danh tế bào của tấm biểu mô NMM nuôi cấy 29
1.4.5. Ứng dụng lâm sàng của tấm biểu mô NMM 34
1.4.5.1. Ứng dụng trong nhãn khoa 34
1.4.5.2. Ứng dụng lâm sàng trong các lĩnh vực khác 36
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu 37
2.1. l.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu: 37
2.1.2. Mô hình nghiên cứu 37
2.2. Quy trình nuôi cấy 38
2.2.1. Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết cho nuôi cấy 38
2.2.2. Thực nghiệm trên thỏ 39
2.2.2.1. Chuẩn bị màng ối 39
2.2.2.2. Chuẩn bị lớp 3T3 làm nền nuôi cấy 41
2.2.2.3. Chuẩn bị mảnh mô NMM cho nuôi cấy 44
2.2.2.3. Môi trường nuôi cấy, quy trình nuôi cấy và theo dõi 48
2.2.2.4. Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy 49
2.2.3. Thử nghiệm trên BN tự nguyện 53
2.3. Chỉ tiêu nghiên cứu 54
2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 54
2.5. Thiết kế nghiên cứu 54
2.6. Xử lí số liệu nghiên cứu 54
2.7. Đạo đức nghiên cứu 54
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55
3.1. Kết quả nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm. . 55
3.1.1. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy 55
3.1.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy 58
3.1.3. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 59
3.1.4. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô được nuôi cấy bằng
các phương pháp khác nhau 61
3.1.5. Hình thái và tốc độ phát triển của lớp nguyên bào sợi 73
3.1.6. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch.. 76
3.1.7. Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy cho thỏ gây bỏng thực nghiệm 78
3.2. Kết quả nuôi cấy tấm biểu mô NMM từ tế bào gốc NMM trên người . 79
3.2.1. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy 79
3.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy 82
3.2.3. Lựa chon phương pháp nuôi cấy 82
3.2.4. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô 83
3.1.5. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch 90
3.1.6. Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy 92
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 93
4.1. Về lựa chọn nền nuôi cấy 93
4.2. Về vị trí và kích thước của mảnh NMM dùng cho nuôi cấy 98
4.3. Về môi trường nuôi cấy 100
4.4. Về phương pháp nuôi cấy 105
4.4.1. Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô 105
4.4.2. Phương pháp nuôi bằng dịch treo 107
4.4.3. Phương pháp nuôi bằng mảnh biểu mô 111
4.5. Về chất lượng tấm biểu mô nuôi cấy 112
4.6. Vấn đề tồn tại cần nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình nuôi
cấy tấm biểu mô NMM 116
KẾT LUẬN 121
KHUYẾN NGHỊ 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
1. Hình ảnh sinh thiết giác mạc thỏ sau ghép ở các thời điểm
2. Hình ảnh mắt của BN sau phẫu thuật ghép tấm biểu mô NMM tự thân
3. Quy trình nuôi cấy tấm biểu mô NMM
Hình 1.1. Giác mạc thỏ bình thường 4
Hình 1.2. Cấu trúc biểu mô NMM 8
Hình 1.3. Sơ đồ biệt hoá tế bào 9
Hình 2.1. Mô hình nghiên cứu 38
Hình 2.2. Mô hình nuôi cấy bằng mảnh mô 45
Hình 2.3. Mô hình nuôi cấy bằng dịch treo 46
Hình 3.1. Niêm mạc thỏ vùng giữa má 56
Hình 3.2. Niêm mạc thỏ vùng giữa má 56
Hình 3.3. Niêm mạc môi thỏ 57
Hình 3.4. Tấm biểu mô sau nuôi cấy ba ngày 61
Hình 3.5. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày 62
Hình 3.6. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày 63
Hình 3.7. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 3 ngày 63
Hình 3.8. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 7 ngày 64
Hình 3.9. Lát cắt đứng dọc của tấm biểu mô sau 21 ngày nuôi cấy 65
Hình 3.10. Tấm biểu mô sau nuôi cấy dịch treo 14 ngày 65
Hình 3.11. Ranh giới giữa hai tế bào tấm biểu mô nuôi cấy 66
Hình 3.12. Tấm biểu mô nuôi cấy 4 ngày 67
Hình 3.13. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 7 ngày 68
Hình 3.14. Tấm biểu mô sau nuôi cấy 12 ngày 68
Hình 3.15. Lát cắt đứng dọc của tấm biểu mô sau 21 ngày nuôi cấy 69
Hình 3.16. Sau nuôi cấy bằng mảnh biểu mô 14 ngày 70
Hình 3.17. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy sau 14 ngày 70
Hình 3.18. Ranh giới các tế bào biểu mô tấm biểu mô nuôi cấy sau 14 ngày … 71 Hình 3.19. Tế bào lớp đáy tấm biểu mô nuôi cấy thỏ sau nuôi cấy 14 ngày . 72 Hình 3.20. Mặt đáy tế bào biểu mô sát với màng ối sau nuôi cấy 14 ngày … 73 Hình 3.21. Lớp 3T3 chuẩn bị cho nuôi cấy 74
Hình 3.22. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 3 75
Hình 3.23. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 5 75
Hình 3.24. Sự phát triển của nguyên bào sợi đáy giếng nuôi cấy ngày 10 76
Hình 3.25. Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày 77
Hình 3.26. Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày 77
Hình 3.27. Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày 78
Hình 3.28. Niêm mạc vùng giữa má BN Phạm Ngọc T 80
Hình 3.29. Niêm mạc vùng giữa má BN Phạm Ngọc T 80
Hình 3.30. Niêm mạc vùng giữa má BN Võ Nữ Ngọc Y 81
Hình 3.31. Niêm mạc vùng giữa má BN Võ Nữ Ngọc Y 81
Hình 3.32. Tấm biểu mô NMM của BN Nguyễn Hữu C. 14 tuổi 83
Hình 3.33. Tấm biểu mô NMM của BN Phạm Ngọc T. 24 tuổi 84
Hình 3.34. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L 85
Hình 3.36. Cấu trúc tế bào bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L 87
Hình 3.37. Ranh giới giữa các tế bào biểu mô nuôi cấy BN Nguyễn Văn L 88
Hình 3.39. Tế bào lớp đáy của tấm biểu mô NMM nuôi cấy BN Lê Văn L. 90
Hình 3.40. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy của BN Hoàng Tiến D 91
Hình 3.41. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy của BN Nguyễn Văn N 91
Hình 4.1. Mảnh mô gọt sau ghép 12 tháng của BN Võ Vũ Ngọc Y 98
Hình 4.2. Lớp biểu mô sau khi bóc tách 108
Hình 4.3. Lớp biểu mô sau khi nạo lấy lớp đáy 109
Hình 4.4. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy ngày 16 113
Hình 4.5. Tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 114
Hình 4.6. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 18 ngày của BN Nguyễn Hữu L. 27 tuổi 118 Hình 4.7. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 21 ngày của BN Lê Văn N. 16 tuổi
(dễ bóc) 119
Hình 4.8. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy 21 ngày của BN Lê Văn N. 16 tuổi
(khó bóc) 119
Bảng 1.1. Kết quả nghiên cứu lâm sàng của cấy ghép tấm biểu mô NMM . 35 Bảng 3.1. Tỷ lệ mọc của tấm biểu mô NMM bằng các môi trường nuôi cấy
khác nhau 58
Bảng 3.2. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM bằng các phương
pháp nuôi cấy khác nhau 59
Bảng 3. 3. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM sử dụng lớp tế bào
nuôi 3T3 60
Bảng 3.4. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô NMM sử dụng lớp tế bào nuôi khác nhau 60