Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, bảo quản và bước đầu thăm dò khả năng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thành dạng tế bào cơ tim

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại. Một trong những phương hướng của y học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh. Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với quá trình phục hồi của các mô có tính biệt hóa cao (thần kinh, mô cơ tim). Liệu pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90]. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell – MSC) là một trong ba loại tế bào gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những đặc tính sinh học vượt trội, đang là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu tái tạo phục hồi mô cơ tim [74],[116]. Việc sử dụng MSC trong nghiên cứu và điều trị không vi phạm pháp luật và đạo đức y học. Tuy nhiên, MSC là một quần thể tế bào gốc hiếm, tồn tại rải rác, xen kẽ trong nhiều mô với tỷ lệ rất thấp, do vậy những nghiên cứu về MSC đều được tiến hành trên các tập hợp MSC hình thành sau các quá trình phân lập, nuôi cấy ngoài cơ thể.

Từ đầu thế kỷ XX cho đến nay, bệnh tim mạch là một bệnh lý phổ biến trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng. Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu ca nhồi máu cơ tim (NMCT) với tỷ lệ tử vong là 25% trong ba năm; có xấp xỉ 5 triệu bệnh nhân suy tim với tỷ lệ tử vong hàng năm là 20% [47]. Ở Việt Nam, số lượng bệnh nhân tim mạch cũng ngày một tăng cao do tuổi thọ được cải thiện cũng như sự gia tăng các yếu tố nguy cơ. Kỹ thuật ghép tim không chỉ hạn chế về nguồn hiến tặng, mà hiện nay vẫn tồn tại những vấn đề về kỹ thuật ghép và chi phí sau ghép. Liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý cơ tim nói chung và NMCT nói riêng được cho là có thể khắc phục được cả hai vấn đề nêu trên.

Hàng loạt thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp tế bào gốc tủy xương không chọn lọc, tiếp theo là liệu pháp MSC chọn lọc từ tủy xương đã được tiến hành, cho thấy tính hiệu quả và tính an toàn của các liệu pháp này đối với bệnh tim mạch.

Tại Việt Nam, sử dụng tế bào gốc của tủy xương hướng tới việc điều trị bệnh tim mạch đã được bắt đầu. Kết quả điều trị cấy ghép tế bào gốc tủy xương đầu tiên trên 6 bệnh nhân suy tim nặng sau NMCT được thực hiện tại Viện Tim mạch Quốc gia là rất đáng khích lệ [4],[6]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu phân lập nhằm tạo ra một tập hợp MSC từ tủy xương với đầy đủ các bằng chứng về tiêu chuẩn nhận biết là hết sức cần thiết, sẵn sàng cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sử dụng chọn lọc MSC sau này. Các bằng chứng về khả năng biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế bào cơ tim của tập hợp MSC nuôi cấy vừa chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC, vừa góp phần giải thích cơ chế tác dụng cải thiện chức năng tim thu được sau liệu pháp tế bào gốc trên 6 bệnh nhân NMCT như đã trình bày ở trên.

Mục tiêu của đề tài:

1. Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người.

2. Nghiên cứu áp dụng một số quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô thành dạng tế bào cơ tim.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt

Mục lục

Danh mục các bảng, biểu đồ Danh mục các hình vẽ, hình ảnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc 3

1.1.1. Tế bào gốc và cách gọi tên 3

1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc 5

1.1.3. Tế bào gốc của tủy xương 7

1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells) 10

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu 10

1.2.2. Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô 11

1.2.3. Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô 16

1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy 19

1.2.5. Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô 20

I

sy T»1 1 r 1 ^ 1 ^ ^ 1 • A A • ^ J ^ 1 ^ ^ Ả ^

.3. Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cây tế bào gốc trung mô tủy xương người 23

1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô 23

1.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô 26

1.4. Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch 28

1.4.1 Những vấn đề cơ bản của liệu pháp tế bào đối với bệnh lý tim mạch. 28

1.4.2. Sự hình thành tim thời kỳ phôi thai và tín hiệu điều tiết 29

1.4.3. Hình thái học tế bào cơ tim và mô cơ tim trưởng thảnh 33

1.4.4. Các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch… 35 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1. Đối tượng và chất liệu nghiên cứu 38

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 38

2.1.2. Chất liệu nghiên cứu 38

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 38

2.2.1. Dụng cụ 38

2.2.2. Trang thiết bị 38

2.2.3. Hóa chất, thuốc thử 39

2.3. Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 40

2.3.2. Các quy trình phân lập, nhân nuôi, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người theo hướng dạng tế bào cơ tim 42

2.3.3. Kỹ thuật đánh giá sự thành công của các quy trình được áp dụng 46

2.4. Địa điểm nghiên cứu 55

2.5. Đạo đức trong nghiên cứu 56

2.6. Xử lý số liệu 56

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 57

3

-* ~w X ^ Ả A • A 1 ^ 1 • ^ ^ 1 ‘ ^ ỉ ^

.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô tủy xương 57

3.1.1. Tỷ lệ áp dụng thành công quy trình phân lập – nhân nuôi và quy trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người…. 57

3.1.2. Kết quả định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập – nuôi cấy 57

3.1.3. Kết quả phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô sau bảo quản 73

_ Ị _ _ _ Ị Ị _ _ ?

3

^ X 7~ A Ả *? _ _ 1_ • A _ _ ‘ J A 1_ ‘ _ _ A _ J __A /V • /V .1

.2. Kết quả nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim 75

3.2.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo trình của Tomita và cs… 75

3.2.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Shim và cs 87

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 88

m ^ 1 ^ A • ^ 1 ^ 1 • ^ J ^ 1 *? J ^ 1 ^ ^ Ả ^ Ả ‘ ỉ *?

Phân lập, nuôi cây, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89

Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89

Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 94

Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 102

Biệt hóa tế bào gốc trung mô nuôi cây theo hướng dạng tế bào cơ tim 102

Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tạo dạng tế

bào cơ tim 103

Kết quả biệt hóa theo hướng dạng tế bào cơ tim 105

KÉT LUẬN 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤCs