Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, bảo quản và bước đầu thăm dò khả năng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thành dạng tế bào cơ tim

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại. Một trong những phương hướng của y học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương ton bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh. Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với quá trình phục hồi của các mô có tính biệt hóa cao (thần kinh, mô cơ tim). Liệu pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90]. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell – MSC) là một trong ba loại tế bào gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những đặc tính sinh học vượt trội, đang là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu tái tạo phục hồi mô cơ tim [74],[116]. Việc sử dụng MSC trong nghiên cứu và điều trị không vi phạm pháp luật và đạo đức y học. Tuy nhiên, MSC là một quần thể tế bào gốc hiếm, tồn tại rải rác, xen kẽ trong nhiều mô với tỷ lệ rất thấp, do vậy những nghiên cứu về MSC đều được tiến hành trên các tập hợp MSC hình thành sau các quá trình phân lập, nuôi cấy ngoài cơ thể.
Từ đầu thế kỷ XX cho đến nay, bệnh tim mạch là một bệnh lý phổ biến trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng. Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu trường hợp nhồi máu cơ tim (NMCT) với tỷ lệ tử vong là 25% trong ba năm; có xấp xỉ 5 triệu bệnh nhân suy tim với tỷ lệ tử vong hàng năm là 20% [47]. Ớ Việt Nam, số lượng bệnh nhân tim mạch cũng ngày một tăng cao do tuổi thọ được cải thiện cũng như sự gia tăng các yếu tố nguy cơ. Kỹ thuật ghép tim không chỉ hạn chế về nguồn hiến tặng, mà hiện nay vẫn tồn tại những vấn đề về kỹ thuật ghép và chi phí sau ghép. Liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý cơ tim nói chung và NMCT nói riêng được cho là có thể khắc phục được cả hai vấn đề nêu trên. Hàng loạt thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp tế bào gốc tủy xương không chọn lọc, cũng như liệu pháp MSC chọn lọc từ tủy xương đã được tiến hành, cho thấy tính hiệu quả và tính an toàn của các liệu pháp này đối với bệnh nhân tim mạch.
Tại Việt Nam, sử dụng tế bào gốc của tủy xương hướng tới việc điều trị bệnh tim mạch đã được bắt đầu. Kết quả điều trị cấy ghép tế bào gốc tủy xương đầu tiên trên 6 bệnh nhân suy tim nặng sau NMCT được thực hiện tại Viện Tim mạch Quốc gia là rất đáng khích lệ [4],[6]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu phân lập nhằm tạo ra một tập hợp MSC từ tủy xương với đầy đủ các bằng chứng về tiêu chuẩn nhận biết là hết sức cần thiết, sẵn sàng cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sử dụng chọn lọc MSC sau này. Các bằng chứng về khả năng biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế bào cơ tim của tập hợp MSC nuôi cấy một lần nữa chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC và góp phần giải thích cơ chế tác dụng cải thiện chức năng tim thu được ở bệnh nhân NMCT sau sử dụng liệu pháp tế bào gốc như đã trình bày ở trên.
Mục tiêu của đề tài:
1.    Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người.
2.    Nghiên    cứu    áp    dụng    một    số    quy trình    biệt hóa    tế    bào    gốc    trung mô
thành dạng tế bào cơ tim.
Danh mục các hình vẽ, hình ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ    1
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU    3
1.1.    Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc    3
1.1.1.    Tế bào gốc và cách gọi tên    3
1.1.2.    Những đặc điểm chung của tế bào    gốc    5
1.1.3.    Tế bào gốc của tủy xương    7
1.2.    Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell)    10
1.2.1.    Lịch sử nghiên cứu    10
1.2.2.    Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô    11
1.2.3.    Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô    17
1.2.4.    Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi    cấy    20
1.2.5.    Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô …. 21
.3. Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cây tế bào gốc trung mô tủy xương người    24
1.3.1.    Phân lập tế bào gốc trung mô    25
1.3.2.    Nuôi cấy tế bào gốc trung mô    27
1.4.    Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch    29
1.4.1.    Sự cần thiết áp dụng liệu pháp tế bào    29
1.4.2.    Sự hình thành tim thời kỳ phôi thai và tín hiệu điều tiết    31
1.4.3.    Hình thái học tế bào cơ tim và mô cơ tim trưởng thành    35
1.4.4. Các thử nghiệm lâm sàng tế bào    gốc    37
Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    40
2.1.    Đối tượng và chất liệu nghiên cứu    40
2.1.1.    Đối tượng nghiên cứu    40
2.1.2.    Chất liệu nghiên cứu    40
2.2.    Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất    40
2.2.1.    Dụng cụ    40
2.2.2.    Trang thiết bị    41
2.2.3.    Hóa chất, thuốc thử    41
2.3.    Phương pháp nghiên cứu    43
2.3.1.    Thiết kế nghiên cứu    43
2.3.2.    Các quy trình phân lập, nhân nuôi, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người    theo hướng dạng tế bào cơ tim … 44
2.3.3.    Kỹ thuật đánh giá sự thành công của các    quy trình    được áp dụng . 48
2.4.    Địa điểm nghiên cứu    58
2.5.    Đạo đức trong nghiên cứu    59
2.6.    Xử lý số liệu    59
Chương III: KẾT QUẢ    60
3.1.    Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô tủy xương    60
3.1.1.    Tỷ lệ áp dụng thành công quy trình     60
3.1.2.    Kết quả định danh tế bào gốc trung mô sau    phân lập, nuôi    cấy …. 60
3.1.3.    Kết quả phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung    mô sau bảo quản    76
3.2.    Kết quả nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tế bào cơ tim    78
3.2.1.    Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô
theo quy trình của Tomita và cs    78
3.2.2.    Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô
theo quy trình của Shim và cs    91
Chương IV: BÀN LUẬN    92
4.1.    Phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người    92
Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người    93
Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người . 98
Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người … 107
4.2.    Biệt hóa tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tế bào cơ tim    107
Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tế bào cơ tim    108
Kết quả biệt hóa theo hướng tế bào cơ tim    110
KẾT LUẬN    119
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH    120
TÀI LIỆU THAM KHẢO    121
PHỤ LỤC