Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy In vitro tế bào gan phôi thai Người

Tế bào gốc được xem như một nguồn tế bào tiềm  năng  cho việc  khôi  phục  và  tái  tạo  lại những tổn thương của mô và cơ quan. Chúng có khả năng tự làm mới và biệt hoá thành các loại tế bào khác nhau, từ đó  có thể biệt hoá  thành các  mô  và  cơ quan đặc  hiệu  [1]. Tế  bào  gốc được chia thành hai nhóm lớn: tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành. Mỗi loại đều có những  tiềm  năng  khác  nhau về  khả  năng  biệt hóa và khả năng ứng dụng. Gan là một cơ quan đích mà  ở  đó,  khả  năng  ứng  dụng  các  nghiên cứu vể việc sử dụng tế bào gốc vào điều trị đã và đang mang lại những dấu ấn đáng ghi nhận [2].

Trong cơ thể, gan là một trong các cơ quan có khả năng tái tạo lại cao nhất sau khi bị tổn thương, tuy nhiên có rất nhiều bệnh lý của gan làm  cho tế  bào  gan bị tổn  thương không  hồi phục, rối loạn  chức  năng và  dẫn  đến  suy gan.

Cắt bỏ gan một phần cho đến nay đã không còn được áp dụng, vì chỉ còn lại rất ít các tế bào có khả   năng  đảm  nhiệm  các  chức  năng  bình thường của gan. Ghép gan hiện nay là phương pháp điều trị hiệu quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Tuy nhiên, vì lý do thải ghép và số lượng người cho gan rất hạn chế, nên các  phương pháp  điều  trị khác  vẫn  cần  được tiếp tục nghiên cứu. Trong bối cảnh đó, tế bào gốc đã và đang là một “nguồn cho” vô tận, có thể thay thế các tế bào gan và tái tạo lại vùng gan bị tổn thương [2].

Có rất nhiều nguồn tế bào gốc được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan (hepatocyte – like cell), như tế bào gốc phôi (ES) [3], tế bào gốc ở người trưởng thành (Adult stem cell) có nguồn gốc từ tuỷ xương (HSCs, MSCs) [4], từ mô mỡ (MSCs) (4), từ máu cuống rốn (MSCs) [4], từ nước ối (MSCs) [5], từ gai rau (MSCs) [6], từ gan (OCs) [7].

Với mục đích nghiên cứu biệt hoá tế bào gan invitro và invivo, năm 2006, bệnh viện Nhi Trung ương đã  thực  hiện  đề  tài  cấp  bộ  mang tên:  “Nghiên  cứu  ghép  tế  bào  gan  phôi  thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hoá di truyền ở trẻ em”. Đề tài sử dụng nguồn tế bào gan phôi thai người. Đây là loại tế bào có đặc tính của tế bào gốc (bi – potent), chúng thể hiện hai loại  dấu  ấn  sinh học  của  tế  bào  gan và  tế bào đường mật.

Trong quá trình phát triển của phôi thai, gan được hình thành từ mầm của lá thai trong (tuần thứ 3 của thai kỳ ở người) cùng với sự ra đời của một phần phổi, tuỵ và tuyến giáp. Những tế bào này nhân lên, hình thành một phần chính là nguồn  gốc  của  gan, bao gồm  các  tế  bào  gan phôi thai, sau này sẽ biệt hoá thành tế bào gan và tế bào đường mật [8].

Về khả năng ghép, tế bào gan phôi thai có nhiều ưu điểm hơn tế bào gan trưởng thành. Kích thước của chúng nhỏ hơn, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình vượt khỏi hàng rào nội mô của xoang tĩnh mạch để xâm nhập vào nhu mô gan. Khả năng nhân lên cao hơn, và có thể thu được hiệu quả điều trị tốt hơn với số lượng tế bào ít hơn.

Với  các  lý  do  trên,  chúng  tôi  tiến  hành nghiên cứu với mục tiêu:

1. Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người

2. Nghiên cứu đặc tính sinh học invitro của tế bào gan phôi thai người

3. Nghiên  cứu  hiệu  quả  đánh  dấu  của  hai loại  marker khác  nhau, lựa  chọn  vào  nghiên cứu invivo.

II. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Phân  lập  và  nuôi  cấy  tế  bào  gan  phôi thai người

Phân lập tế bào gan phôi thai người

Gan phôi thai người từ 10 – 13 tuần tuổi được thu thập  từ  các  trường  hợp  phá  thai tự  nguyện của bệnh viện Phụ Sản Hà Nội. Các mảnh gan được phân lập ra khỏi các tổ chức khác của thai nhi bằng mắt thường hoặc với sự trợ giúp của kính hiển vi, sau đó sẽ được phân lập thành tế bào gan theo phương pháp của Mahieu – Caputo tại   phòng   thí  nghiệm   00  –  20,  bệnh   viện Kremlin Bicetre. Các mảnh gan này sau khi được rửa hai lần bằng dung dịch rửa HEPES, 500rpm/ phút trong 2 phút, sẽ được phân tách bằng dung dịch Collagenase A type 3 ở 370C trong 1 giờ, nồng độ từ 1 đến 2mg/ml tuỳ theo tuổi thai. Hỗn hợp tế bào sau khi phân tách được lọc qua một màng lọc 70µm, ly tâm 500 rpm/phút trong 5 phút. Khối tế bào thu được sẽ được rửa 3 lẩn bằng môi trường nuôi cấy tế bào gan. Cuối cùng, các tế bào sẽ được đánh giá về số lượng và tỷ lệ sống bằng nhuộm với trypan blue (đánh dấu nhân các tế bào chết) trên kính hiển vi thường.

Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người

Tế bào gan sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa Petri (Corning, 25000 tế bào/cm2) với môi trường nuôi cấy tế bào gan trong vòng năm ngày. Môi trường nuôi cấy này được thay thế bằng một loại môi trường dinh dưỡng khác vào các   ngày   sau  đó   là   DMEM  –  HAM’S  F12 medium William E (Sigma), bao gồm thêm các thành phần sau: Penicillin 100Ul/ml; Streptomycin 100µg/ml (Gibco), 2mM Gluta- mine (Gibco), 0.1% Serum Bovine Albumine (Sigma), 10-6M  3 – 3’ – Triiodo – L – Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisone (MP), 10-8M Insuline (MP), 0.24% acide linoleique (2: 1) (Sigma), 1mg/ml apo – transferrine (Sigma) và 100 µg/ml Vitamine C (Roche)

2. Hoá miễn dịch tế bào

Tế bào gan phôi thai người sau khi được nuôi cấy trong vòng 5 ngày, tế bào được đánh giá về các marker đặc hiệu cho tế bào gan và tế bào đường  mật,  bằng  phản  ứng  hoá  miễn  dịch tế bào. Sau khi được rửa ba lần với PBS 1X, tế bào được  cố  định trong 5 phút  ở  nhiệt  độ  phòng bằng PBS – triton 0,1% cho loại kháng thể anti- cytokeratin (CK), và bằng PBS – PFA (Paraformadehyde 4%) cho các loại kháng thể khác. Sau đó, tế  bào được  rửa  3 lần  bằng  PBS 1X và ủ trong PBS – Gelatine 1% trong 1h. Sau đó, tế bào lần lượt được ủ với các loại kháng thể khác nhau (1/100) (Dako): anti – albumin, anti alpha – 1 – trypsine, anti – CK19, anti – CK8/18, anti – CK7, anti – E – cadherine. Kháng thể thứ nhất được phát hiện bới kháng thể thứ hai gắn tín  hiệu  huỳnh  quang  FITC  (1/1500)  (Dako). Cuối cùng, tiêu bản đựoc phủ một lớp DAPI antiface, cho phép xác định nhân tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.

3. Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro

Với mục đích để đưa tế bào vào các thử nghiệm invivo, các tế bào trước khi ghép cần được đánh dấu. Hai loại chất đánh dấu được thử nghiệm. CFSE (Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl  ester),  là  chất  đánh  dấu  màng nhân  và  bào  tương. Hoechst là  chất  đánh  dấu vào chất nhân của tế bào.

3.1 Hoechst

Ủ  20  x  106   tế  bào  trong  2ml  môi  trường không có FBS với 10µl Hoechst (Sigma) trong 30 phút ở 370C. Hoà tan khối tế bào với 10ml môi trường có FBS pha loãng 1/10 để kết thúc phản ứng. Rửa khối tế bào 3 lần, nuôi cấy và kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang.

3.2. CFSE

CFSE stock ở 5mM, được pha loãng với các nồng độ khác nhau: 4µM, 8µM, 10µM trong môi trường không có FBS, để có được nồng độ pha loãng cuối cùng trong khối tế bào là 1µM, 4µM, 5µM, ủ trong 10 phút ở 370C. Sau đó, một khối lượng  gấp  đôi số  thể  tích của  tế  bào  được  cho vào  để  kết  thúc  phản  ứng,  và  tế  bào  được  ủ trong đá lạnh khoảng 5 phút. Rửa khối tế bào 3 lần,  nuôi  cấy  và  kiểm  tra  dưới  kính  hiển  vi huỳnh quang.