Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Luận văn Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne Muscular Dystrophy ( DMD) hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại được phát hiện trên nhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới là một bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai
Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ: biểu hiện là khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp
Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 3000 Kb, bao gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Gen sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng hợp protein dystrophin. Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và được cho là có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Gen dystropin bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD. Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker Muscular Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất hiện muộn hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.
Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn (khoảng 60%), đột biến điểm ( 25-30%), đột biến lặp ( 10-15%)
Như có thể thấy dạng đột biến xóa đoạn là phổ biến nhất, thường gặp nhất chiếm tỉ lệ trên một nửa số ca bệnh. Đột biến này thường xảy ra ở hai vùng trọng điểm (gọi là vùng hotspot) là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’.
Cho đến nay DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài ra,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh. Có nhiều phương pháp xác định đột biến xóa đoạn gen này nhưng do gen dystropin quá lớn với 79 exon, nên nhiều phương pháp gặp phải trở ngại về mặt thời gian. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là phương pháp xác định đột biến xóa đoạn và lặp đoạn nhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi.
Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne” được thực hiệnnhằm mục tiêu:
Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN3
1.1Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.3
1.1.1. Trên thế giới.3
1.1.2. Ở Việt Nam.5
1.2. Đặc điểm bệnh DMD6
1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD6
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng8
1.2.3. Điều trị bệnh DMD9
1.2.4. Phòng bệnh DMD10
1.3 Cơ chế di truyền của bệnh11
1.4. Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin12
1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin12
1.4.2. Cấu trúc gen Dystrophin12
1.5. Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin13
1.6.Đột biến xóa đoạn gen Dystrophin14
1.7. Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn gen dystropin.17
1.7.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction17
1.7.2. Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU23
2.1. Đối tượng nghiên cứu23
2.2. Phương pháp nghiên cứu.23
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu24
2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị24
2.3.2. Hóa chất24
2.4. Quy trình kỹ thuật26
2.4.1. Lấy mẫu máu26
2.4.2. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi26
2.4.3 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA28
2.4.4. Thực hiện phản ứng PCR:28
2.4.5. Chạy điện di kiểm tra sản phẩm29
2.4.6. Thực hiện kỹ thuật MLPA.30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU33
3.1. Kết quả tách chiết DNA.33
3.2.1. Kết quả xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin bằng MLPA.34
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN41
4.1. Quy trình tách chiết DNA.41
4.2. Xác định đột biến mất đoạn gen.42
4.3. Phân tích các ưu, nhược điểm của kỹ thuật MLPA so với PCR:45
KẾT LUẬN47
KIẾN NGHỊ48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO¬
TIẾNG VIỆT
1.Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Thu Nhạn, Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trần Vân Khánh, Masafumi Matsuo (2006), “Đột biến mất đoạn gen Dystrophin của các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker Việt Nam”, Hội Nhi khoa Việt Nam, Đại hội hội Nhi khoa Việt Nam lần thứ XVIII 4/5/2006, tr.202-8.
2.Đặng Diễm Hồng, Luyện Quốc Hải, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trần Vân Khánh (2006).“ Phân tích và phát hiện 10 trường hợp đột biến gen Dystrophin ở 33 bệnh nhân Việt Nam được chẩn đoán Duchenne, Becker”, Tạp chí nghiên cứu Y học, số1, 1/2006.
3.Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh và Tạ Thành Văn(2005). “Phát hiện một trường hợp đột biến dài 27 exon ở vùng Rod của gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học Việt Nam 4, tr: 23-28.
4.Trần Vân Khánh và Tạ Thành Văn (2005). “Phát hiện một trường hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin gen ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học thực hành 2, tr: 12-16.
5.Trần Vân Khánh (2005) . “Đột biến ở vùng Rod của gen Dystrophin gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học Việt Nam 6, 33-39.
6.Tạ Thành Văn “PCr và một số kỹ thuật sinh học phân tử”.
7.Trần Vân Khánh, Matsafumi Matsuo và CS (2004). “Chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh nhược cơ Duchenne/ Becker bằng phương pháp PCR”. Tạp chí Y học Việt Nam. Tr 33-38.
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất