Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phố biến ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. UTV chiếm gần 30% các loại UT ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 2 trong số các loại ung thư. Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư thế giới, năm 2008, trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chan đoán và

458.503 ca tử vong [49]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV ở Hà Nội là khoảng 30/100.000 dân và ở TP Hồ Chí Minh là khoảng 20/100.000 dân, đứng đầu trong các loại UT ở phụ nữ [13].

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong tầm soát, phẫu thuật và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp bệnh nhân UTV nguyên phát ở giai đoạn sớm vẫn bị tái phát bệnh hoặc tử vong. Các phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker). Mỗi loại phương pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn đoán chính xác và sớm UTV. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều phương pháp mới giúp cho việc 

chấn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã được ứng dụng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các đột biến gen liên quan tới UT. Việc phát hiện các đột biến gen UT lấy từ các mô UT, hạch bạch huyết hoặc tủy xương chỉ có thể thực hiện khi sinh thiết hoặc sau phẫu thuật do vậy nhược điểm là phát hiện muộn khi khối u đã lớn. Vì vậy, việc chấn đoán UT thường ít còn ý nghĩa và không giúp cho việc điều trị có hiệu quả cũng như việc theo dõi điều trị. Do vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu nhằm phát hiện di căn tiềm ấn từ giai đoạn sớm của bệnh nhân ung thư là cần thiết. Các tế bào UT có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyên phát hoặc các khối u đã di căn, thâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell – CTC). Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các tế bào UT trước khi có các biểu hiện lâm sàng [22]. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu đóng vai trò quan trọng, có thể góp phần xác định sớm các trường hợp di căn, giúp cho việc chấn đoán và điều trị có hiệu quả. Một số gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó có gen mã hóa survivin. Gen survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Gen này được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không biểu hiện ở các mô bình thường [11]. Do vậy, việc phát hiện gen survivin trong máu có thể góp phần chấn đoán, tiên lượng và theo dõi điều trị bệnh nhân UTV [18], [38], [50]. Đặc biệt khi kết hợp với các gen khác như survivin, hTERT và hMAM [41]. Vì vậy, để góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu chấn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú ” với 2 mục tiêu:

1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú.

2. Đánh giá khả năng ứng dụng xét nghiệm gen survivin trong chẩn đoán ung thư vú.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 7 

Chương 1: TÔNG QUAN

1.1. Bệnh ung thư vú

1.1.1. Khái niệm bệnh 9

1.1.2. Dịch tễ học UTV 9

1.1.3. Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú. 11

1.1.4. Chẩn đoán ung thư vú 15 

1.1.5. Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV 16

1.1.6. Điều trị ung thư vú 18

1.1.7. Các dấu ấn sinh học trong chẩn đoán và theo dõi điều trị UTV. 18

1.2. Gen survivin trong ung thư vú

1.2.1. Khái quát về sự chết theo chương trình của tế bào 23

1.2.2. Survivin 24

1.2.3. Survivin trong ung thư vú 27

1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện gen từ các tế bào ung thư 31

1.3.1. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC)

31

1.3.2. Kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry- ICC)

32

1.3.3. PCR 33

1.3.4. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) 35

1.3.5. Real-time PCR 37

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1. Đối tượng nghiên cứu 39

2.2. Phương tiện nghiên cứu 39

2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu 39

2.2.2. Hóa chất 40

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40

2.4. Các bước nghiên cứu 41 

2.4.1. Quy trình nghiên cứu 41

2.4.2. Các bước nghiên cứu 41

2.5. Vấn đề đạo đức của đề tài

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng bản sao gen survivin ở tế

bào nuôi cấy KPL4

3.1.1. Thiết kế mồi 56

3.1.2. Nuôi cấy tế bào dòng ung thư vú KPL4 56

3.1.3. Tách chiết RNA tổng số. 57

3.1.4. Tổng hợp cDNA. 58

3.1.5. PCR xác định trình tự gen survivin. 59

3.1.6. Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR với dòng tế bào KPL4 61

3.2. Đánh giá khả năng ứng dụng xét nghiệm gen survivin trong chẩn đoán ung thư vú 63

3.2.1. Phân loại mẫu nghiên cứu theo tuổi 63

3.2.2. Xét nghiệm sinh hóa của bệnh nhân ung thư vú và u xơ tuyến vú.

64

3.2.3. Phân loại mẫu nghiên cứu theo TNM và theo mô bệnh học bệnh UTV

64

3.2.4. Tách chiết RNA tổng số. 65

3.2.5. Tổng hợp cDNA 67

3.2.6. Xác định mức độ biểu hiện của gen survivin trong các mẫu nghiên

cứu. 68

3.2.7. Real-time RT-PCR định lượng bản sao gen survivin từ mẫu mô và

mẫu máu. 71

Chương 4: BÀN LUẬN 77

4.1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú… 78

4.1.1. Thiết kế mồi gen survivin 78 

4.1.2. Nuôi cấy tế bào dòng ung thư vú KPL4 78

4.1.3. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA từ tế bào KPL4. 78

4.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn gen mã hóa gen survivin 80

4.1.5. Kết quả xác định mức độ biểu hiện của gen survivin trong mẫu tế bào KPL4. 80

4.1.6. Kết quả xây dựng đường biểu diễn chuẩn định lượng gen survivin kỹ thuật real-time RT- PCR với dòng tế bào KPL4. 80

4.2. Đánh giá khả năng ứng dụng xét nghiệm gen survivin trong chẩn đoán ung thư vú 82

4.2.1. Kết quả xét nghiệm sinh hóa và dấu ấn ung thư 82

4.2.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA từ máu và mô nghiên cứu. 82

4.2.3. Kết quả xác định mức độ biểu hiện của gen survivin trong các mẫu nghiên cứu 83

4.2.4. Kết quả định lượng số bản sao gen survivin bằngkỹ thuật real-time RT-PCR trong mẫu mô và mẫu máu. 84

4.2.5. Mối liên quan mức độ biểu hiện gen survivin và các chỉ số lâm sàng.

89

KẾT LUẬN 91

KIẾN NGHỊ 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC