Nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy

Bệnh thoái hóa cơ tủy hay bệnh SMA (Spinal Muscular Atrophy-SMA) là một   trong những bệnh lý thần kinh cơ di truyền hay gặp nhất với tần suất bệnh khá cao (1/10.000- 1/25.000) chỉ ñứng sau bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Thoái hóa cơ tủy là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể  số 5. ðột biến gen làm thoái hóa tuần tiến tế bào thần kinh sừng trước tủy sống dẫn ñến suy yếu và thoái hóa ñối xứng gốc chi [2,3]. Trên lâm sàng, bệnh nhi giảm vận ñộng tiến triển với các ñặc trưng là nhược cơ ñối xứng gốc chi, trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực và cứng khớp. ðặc ñiểm khác biệt so với một số bệnh lý thần kinh cơ di truyền khác là ở bệnh nhân này không có biểu hiện rối loạn hoặc mất cảm giác, trí tuệ phát triển bình thường. Dựa vào mức ñộ nặng nhẹ của bệnh trên lâm sàng và tuổi xuất hiện bệnh SMA ñược chia làm 3 thể, trong ñó thể 1 và thể 2 là thể bệnh rất nặng chiếm 3/4 các trường hợp, bệnh nhân thường tử vong trong năm ñầu tiên hoặc muộn hơn ở lứa tuổi ñi học do biến chứng viêm phổi và suy hô hấp [4, 6]. Bệnh SMA gây nên do ñột biến gen SMN1, rất nhiều nghiên cứu ñã cho thấy khoảng 94% bệnh nhân SMA có ñột biến xoá ñoạn exon 7, exon 8 và chỉ khoảng 5-6% có ñột biến ñiểm trên gen SMN1 [5, 7]. ðột biến xóa ñoạn là dạng ñột biến dễ xác ñịnh, không tốn nhiều thời gian, trong khi ñó ñột biến ñiểm khó xác ñịnh hơn do các dạng ñột biến này không tập trung vào một số vị trí ñặc hiệu mà nằm rải rác khắp chiều dài của gen. Với tỉ lệ người lành mang gen bệnh cao (1/50), nguy cơ mắc bệnh trong cộng ñồng cũng rất cao (1/10.000 trẻ), bệnh nặng, tỉ lệ tử vong cao, để lại di chứng nặng nề đã gây ra nhiều hậu quả cho gia đình người bệnh và cho cả cộng ñồng xã hội do vậy bệnh  thực sự không chỉ là một tai họa ñối với bản thân người bệnh mà còn là gánh nặng của gia đình và xã hội.
Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị ñặc hiệu cũng như chưa có biện pháp làm giảm sự tiến triển của bệnh. Bởi vậy, việc chẩn ñoán người lành mang gen bệnh, chẩn ñoán trước sinh ñang ñược ưu tiên lựa chọn, nhờ ñó có thể ñưa ra những lời khuyên di truyền giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh. Xuất phát phát từ thực tiễn ñó ñề tài ñược thực hiện nhằm mục tiêu: Nghiên cứu xác ñịnh người lành mang gen bệnh và chẩn ñoán trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    đối tượng nghiên cứu
Xác định người mang gen bệnh:
10 gia ñình và 2 thai phụ có con bị bệnh thoái hóa cơ tủy ñã ñược xác ñịnh có ñột biến xóa ñoạn exon 7, exon 8. Sử dụng mẫu ñối chứng nam và nữ.
2.    Phương pháp nghiên cứu
    Ky thu¾t tách chiet DNA tong so
Các mẫu DNA ñược tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp phenol/ chloroform.
    Phát hi¾n ngu¤i mang gen b¾nh bang ky thu¾t MLPA
Sử dụng KIT MLPA của hãng Holland, thành  phần,  chu  trình  nhiệt  của  phản  ứng
ñược thực hiện theo như hướng dẫn của nhà
nhiễm sắc thể, và số lần lặp lại sẽ di truyền cho thế hệ sau tùy thuộc vào nhiễm sắc thể ñược nhận. Cặp mồi ñánh dấu huỳnh quang ñã ñược sử dụng ñể khuếch ñại một số vùng gen STR ñặc hiệu cho gen dytrophin trên mẫu ối và mẫu DNA thai phụ. Mỗi vùng STR sẽ tương ứng với một ñỉnh sau ñiện di trên hệ thống mao quản. Phản ứng PCR phân tích gen SMN1 của thai nhi.
–    Sử dụng cặp mồi ñặc hiệu khuếch ñại
exon 7, exon 8 ñược mô tả theo phương pháp của Van der Steege [5,7].
–    Phản ứng PCR ñược tiến hành với  thể tích 20µl gồm các thành phần: 100ng  DNA, 5pmol  primer,  200  µmol/l  dNTP,  2  ñơn  vị enzym Taq polymerase và 2 µl bufer II 20.
–    Exon 7, 8: chu trình nhiệt 940- 7 phút, 35 0    0    0
sản xuất. Exon 7 và exon 8 ñược thiết kế các probe ñặc hiệu, ngoài ra các probe của 10 gen nội chuẩn cũng ñược thiết kế. Exon 7, exon 8 và 10 gen nội chuẩn sẽ chạy trong cùng một phản  ứng  PCR.  Sau  phản  ứng  PCR,  mỗi probe sẽ ñược khuếch ñại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau. Do vậy, chúng sẽ ñược phân tách bằng  phương  pháp  ñiện  di  mao  quản.  Số lượng sản phẩm khuếch ñại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của ñoạn DNA ñích ñặc hiệu với probe ñó. Người mang gen bệnh khi chiều cao ñỉnh exon 7, exon 8 chỉ bằng ½ so với mẫu ñối chứng [8].
    Chan ñoán tru¤c sinh
Kỹ thuật chọc hút dịch ối
được thực hiện vào tuần thứ 14-16 của thai kỳ dưới sự hướng dẫn của siêu âm, kỹ thuật này được tiến hành tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương. Kỹ thuật STR phát hiện khả năng nhiễm DNA của mẹ vào mẫu DNA thai nhi: Trong quá trình lấy mẫu ối việc lẫn máu của mẹ hoàn toàn có thể xảy ra làm cho kết quả không chính xác do khuếch ñại cả DNA của máu mẹ. STR (Short Tandem Repeat) là ñoạn trình tự lặp lại ngắn với số lần lặp lại tùy thuộc vào mỗi cá thể và mỗi vùng khác nhau trên chu kỳ [94 c – 1 phút, 55 c – 1 phút, 72 c – 1
phút], 720c – 7phút. DNA của người bình thường được sử dụng làm mẫu ñối chứng (+), sử dụng mẫu nước cất làm ñối chứng (-) để loại trừ khả năng nhiễm DNA ngoại lai