Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146].

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là một gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là protein dystrophin. Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109].

Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến xóa đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đột biến xóa đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến xóa đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra xóa đoạn [7], [20], [69].

Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến xóa đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA.

Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79 exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Ngược lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau; do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất.

Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận [93], [107].

Ở Việt Nam, năm 2005, Nguyễn Thị Trang và cs nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền.

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng” được tiến hành với các mục tiêu sau:

1. Xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở mức độ mRNA.

2. Phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đình của bệnh nhân đã được xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin.

3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ dị hợp tử mang gen dystrophin đột biến xóa đoạn.

MỤC LỤC

Trang

PHẦN A- TÓM TẮT CÁC KÉT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1. Kết quả nổi bật của đề tài 1

1.1. Đóng góp mới của đề tài 1

1.2. Kết quả cụ thể 2

2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 3

3

TV r 1 * r i 1 1 • ^ 1 > • -tẤ« 1 • Ấ f 4 À 1 • ^ r

. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt 4

3.1. Tiến độ 4

3.2. Thực hiện mục tiêu nghiên cúu 4

3.3. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của Bản đề cương. 4

3.4. Đánh giá việc sử dụng kinh phí. 5

PHẦN B . NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIÉT KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI

Đặt vấn đề 6

Chương 1. Tổng quan tài liệu 9

1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 9

1.2. Đặc điểm của bệnh DMD 16

1.3. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin 20

1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin 30

1.5. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 38

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 40

2.1. Đối tượng nghiên cứu 40

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất. 40

2.3. Phương pháp nghiên cứu 42

2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 49

Chương 3: Kết quả nghiên cứu 50

3.1. Kết quả tách chiết DNA 50

3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 51

3.3. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ RNA 52

3.4. Kết quả xác định người lành mang gen bệnh 58

3.5. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 68

Chương 4. Bàn luận 73

4.1. Qui trình tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 73

4.2. Xác định đột biến gen dystrophin 76

4.3. Xác định người lành mang gen bệnh 86

4.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 95

Kết luận 101

Kiến nghị 102

Tài liệu tham khảo

Phụ lục