Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ cá nóc
Luận án Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ cá nóc.Đại dương với nguồn tài nguyên vô cùng lớn, chiếm tới 70% diện tích bề mặt trái đất. Đại dương cũng là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với hơn 500.000 loài thực – động vật và vi sinh vật (VSV) đã được biết đến. Đây chính là nguồn cung cấp vô số các sản phẩm tự nhiên quý giá từ các loài sinh vật biển như rong biển, chân rết, rêu biển (bryozoan), thân mềm và từ các loài vi khuẩn biển cũng như vi khuẩn lam. Trong đó, khu vực Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương có một vùng đa dạng sinh vật biển nhiệt đới lớn nhất trên thế giới. Nguồn tài nguyên phong phú này gần đây đã thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Nghiên cứu, khai thác tài nguyên sinh vật biển, hiện đang là vấn đề cấp bách không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới. Với sự phong phú và đa dạng sinh vật, đại dương hứa hẹn sẽ là nơi phát triển nhiều hợp chất chứa các hoạt tính quý báu, giúp ích cho những yêu cầu về phát triển và tìm kiếm các loại thuốc mới, hiệu quả, và đặc hiệu trong điều trị những căn bệnh hiểm nghèo hiện nay như ung thư, tim mạch, tiểu đường, HIV/AIDS…
Hiện nay, căn bệnh ung thư và nghiện ma tuý đang là những gánh nặng cho các quốc gia. Việc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng hỗ trợ bệnh nhân ung thư hoặc giúp giảm cơn nghiện ma tuý là mong muốn của nhiều quốc gia, đặc biệt là ngành y tế.
Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố thần kinh không protein (neurotoxin nonprotein), một trong những độc tố tự nhiên có độc tính cao nhất (LD50 = 8-11 µg/kg) với liều gây chết cho người 1 – 2 mg qua đường tiêu hóa [55], [157]. Do ái lực mạnh và có tác dụng chẹn kênh natri một cách đặc hiệu, dẫn tới làm tê liệt dẫn truyền thần kinh, TTX thể hiện tác dụng giảm đau trung ương rất mạnh [157]. TTX được tìm thấy ở rất nhiều loài khác nhau, bao gồm cá nóc, cá bống bóng, sa giông, cóc (ếch độc) và bạch tuộc vòng lam. Cá nóc, đặc biệt trứng của nó, là nguồn TTX được biết tới nhiều nhất. TTX phân bố rất khác nhau ở các loài cá nóc khác nhau, và giữa các bộ phận của cùng một loài cũng rất khác nhau.
Vì vậy, cần phải có các nghiên cứu phân biệt, đánh giá độc tố nhằm hạn chế các vụ ngộ độc, cũng như định hướng nghiên cứu.
Gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, TTX và những chất tương tự TTX(TTX analogues) như: 4- epi TTX, 4-epi anhydro TTX… đang được thử nghiệm như một chất dẫn đường (lead compound) tiềm năng hướng tới điều trị một số bệnh hiểm nghèo như bệnh tim mạch, giảm đau trong ung thư, cai nghiện ma tuý,…[13], [56], [119]. Đểphục vụ nghiên cứu định hướng ứng dụng trong y học, đánh giá được chất lượng và độ 2an toàn các sản phẩm có chứa TTX từ cá nóc thì cần thiết phải có chất đối chiếu hóa học TTX đủ độ tinh khiết để làm chất chuẩn. Vì vậy, việc chiết xuất, phân lập và tinh chế TTX từ cá nóc làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm trở nên hết sức cần thiết, đặc biệt, việc mua chuẩn TTX từ nước ngoài là rất khó khăn và chi phí rất cao (khoảng 200$/1mg TTX).
Mặc dù tetrodotoxin là một hợp chất đã biết từ lâu, có nhiều con đường, phương pháp điều chế, tuy nhiên, hiện nay, chủ yếu TTX vẫn được chiết xuất từ cá nóc. Trong khi Việt Nam với tiềm năng dược liệu biển, trữ lượng cá nóc rất lớn, việc chiết xuất TTXvà các dẫn chất từ cá nóc có ý nghĩa quan trọng. Vì vậy, luận án “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ cá nóc” được thực hiện nhằm các mục tiêu:
– Sàng lọc và phát hiện tetrodotoxin ở một số loài cá nóc.
– Phân lập, xác định cấu trúc một số độc tố thần kinh khác (tetrodotoxin analogues) từcá nóc.
– Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế tetrodotoxin có độ tinh khiết phù hợp để làm chất chuẩn và bước đầu bào chế bột đông khô định hướng sử dụng trong y học
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………………………………………………. 0
LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………………………………………… 0
MỤC LỤC …………………………………………………………………………………………………………… 0
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ………………………………………………. 0
DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………………………….. 0
DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………………………………………………… 0
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ………………………………………………………………………………….. 3
1.1. CÁ NÓC ……………………………………………………………………………………………………… 3
1.1.1. Phân loại ……………………………………………………………………………………………….. 3
1.1.2. Phân bố …………………………………………………………………………………………………. 3
1.1.3. Đặc điểm nhận dạng ……………………………………………………………………………….. 2
1.2. TETRODOTOXIN ………………………………………………………………………………………… 4
1.2.1. Cấu trúc tetrodotoxin và các độc tố tương tự tetrodotoxin ……………………………. 4
1.2.2. Phân bố và nguồn gốc của tetrodotoxin trong tự nhiên ………………………………… 7
1.2.3. Hàm lượng của tetrodotoxin và các dẫn chất trong cá nóc …………………………. 13
1.2.4. Độc tính của tetrodotoxin và các dẫn chất ……………………………………………….. 15
1.2.5. Tác dụng sinh học và cơ chế ………………………………………………………………….. 17
1.2.6. Khả năng ứng dụng của tetrodotoxin trong y học ……………………………………… 20
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TETRODOTOXIN …………………………….. 27
1.3.1. Một số phương pháp chiết xuất, phân lập tetrodotoxin từ tự nhiên ……………… 27
1.3.2. Một số phương pháp điều chế khác …………………………………………………………. 30
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN VÀ
DẪN CHẤT ……………………………………………………………………………………………………… 33
1.4.1. Phương pháp sinh hóa …………………………………………………………………………… 33
1.4.2. Phương pháp quang phổ ………………………………………………………………………… 34
1.4.3. Phương pháp sắc ký ………………………………………………………………………………. 35
1.4.4. Phương pháp phổ khối …………………………………………………………………………… 38
1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ……………………………………………………….. 41
1.5. CHẤT CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ………………………………………… 43
1.5.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học …………………………………………………………………. 43
1.5.2. Phương pháp thiết lập chất chuẩn ……………………………………………………………. 43
1.5.3. Đánh giá liên phòng thí nghiệm ……………………………………………………………… 43
1.5.4. Chất chuẩn tetrodotoxin ………………………………………………………………………… 44
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ………………………………………………………………………………………………………………….. 46
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………… 46
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………….. 46
2.2.1. Hóa chất thuốc thử ………………………………………………………………………………… 46
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ …………………………………………………………………………………… 46
2.2.3. Đô ̣ ng vâ ̣ t thinghiê ̣ m ……………………………………………………………………………… 48
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………… 49
2.3.1. Thu mẫu, định danh, xử lý mẫu, bảo quản, vận chuyển cá nóc từ nơi thu mẫu
đến phòng thí nghiệm …………………………………………………………………………………….. 49
2.3.2. Nghiên cứu phát hiện, định tính, định lượng tetrodotoxin ………………………….. 51
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học, phân lập tetrodotoxin và dẫn chất từ một số
loài cá nóc …………………………………………………………………………………………………….. 55
2.3.4. Chiết xuất và tinh chế tetrodotoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn …….. 56
2.3.5. Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin ……………………………………………………………. 57
2.3.6. Bào chế và tiêu chuẩn hóa bột đông khô tetrodotoxin 0,1 % ………………………. 59
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ………………………………………………………… 63
3.1. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ NGUỒN CÁ NÓC TETRADONTIDAE CÓ
CHỨA TETRODOTOXIN ………………………………………………………………………………….. 63
3.2. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH Ở MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC
(TETRAODONTIDAE) ………………………………………………………………………………………. 64
3.2.1. Xác định nhanh độc tố của phủ tạng một số loài cá nóc …………………………….. 64
3.2.2. Xử lý mẫu, làm sạch qua cột chiết pha rắn ……………………………………………….. 64
3.2.3. Định tính tetrodotoxin bằng sắc ký lớp mỏng …………………………………………… 67
3.2.4. Nghiên cứu phát hiện tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ một số
loài cá nóc bằng các phương pháp hiện đại ……………………………………………………….. 69
3.2.5. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng
khối phổ (LC/MS) …………………………………………………………………………………………. 72
3.2.6. Khảo sát hàm lượng tetrodotoxin trong một số bộ phận của một số loài cá nóc
……………………………………………………………………………………………………………………. 75
3.3. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ
CÁC DẪN CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC …………………………………………………. 80
3.3.1. Phát hiện tetrodotoxin và nhóm chất tương tự tetrodotoxin (TTXs) từ một số
loài cá nóc độc ………………………………………………………………………………………………. 80
3.3.2. Xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh từ một số
loài cá nóc …………………………………………………………………………………………………….. 84
3.3.3. Phân tích xác định cấu trúc các độc tố phân lập được từ 5 loài cá nóc …………. 84
3.4. NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN Ở QUY MÔ
PHÒNG THÍ NGHIỆM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN …… 92
3.4.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tetrodotoxin thô ……………………………………… 92
3.4.2. Tinh chế tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng điều chế ………………………………………. 95
3.5. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU TETRODOTOXIN .. 98
3.6. NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN …………………….. 98
3.6.1. Nghiên cứu độ ổn định của tetrodotoxin trong một số dung môi …………………. 98
3.6.2. Nghiên cứu quy trình đóng ống chuẩn, 100 µg chất/lọ 1 ml, sử dụng dung môi
thích hợp ………………………………………………………………………………………………………. 99
3.6.3. Kiểm tra đánh giá chất lượng ống chuẩn ………………………………………………… 100
3.7. BÀO CHẾ BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ……………………………….. 102
3.7.1. Bào chế bột đông khô ………………………………………………………………………….. 102
3.7.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm nghiệm sản phẩm …………………………….. 103
3.7.3. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của bột đông khô 0,1% …………….. 103
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN …………………………………………………………………………… 114
4.1. VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU NGUỒN CÁ NÓC VÀ ĐỘC TỐ CÁ NÓC …………………. 114
4.2. VỀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH
LƯỢNG ĐỘC TÍNH, ĐỘC TỐ THẦN KINH TETRODOTOXIN VÀ CÁC CHẤT
TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN ……………………………………………………………………….. 115
4.2.1. Sàng lọc, phát hiện độc tính bằng phương pháp sinh hóa chuột ………………… 115
4.2.2. Các phương pháp định tính tetrodotoxin và dẫn chất ………………………………. 115
4.2.3. Các phương pháp định lượng tetrodotoxin ……………………………………………… 116
4.3. PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ NHÓM CHẤT TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN
TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC THU ĐƯỢC TỪ VÙNG BIỂN VIỆT NAM …………… 117
4.4. VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN ĐẠT ĐỘ
TINH KHIẾT LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN …………………….. 119
4.4.1. Chiết xuất …………………………………………………………………………………………… 119
4.4.2. Tinh chế …………………………………………………………………………………………….. 121
4.5. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN ………………………………………….. 122
4.6. BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ……………………………………………….. 122
4.7. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ……………………………………………………………. 123
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………………………………….. 125
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………………………. 125
ĐỀ XUẤT ……………………………………………………………………………………………………… 126
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ……………………………………………. 127
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
ATCC : Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ (American Type Culture Collection)
CI : Kỹ thuật ion hoá hoá học (Chemical ionization)
COSY : Correlation Spectroscopy
cs. : Cộng sự
DEPT : Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
ĐVTN : Động vật thử nghiệm
EI : Kỹ thuật ion hoá điện tử (Electron Ionization)
ELISA : Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)
ESI : Kỹ thuật ion hoá phun sương điện tử (Electric spray ionic)
ED50 Liều của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra ảnh hưởng sinh học
khác nhau cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật thử nghiệm (Effective
Dose 50)
FAB : Kỹ thuật bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment)
FLD : Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)
FT ICR : Phổ cộng hưởng từ gia tốc ion chuyển dạng Fourier (Fourier transform ion
cyclotron resonance)
GC-MS : Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography – Mass spectrum)
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence
LC MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass spectrum)
LC MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ ghép nối khối phổ (Liquid Chromatography tandem Mass
spectrum)
LD100 : Liều tối thiểu của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho
toàn bộ một nhóm động vật thử nghiệm (Lethal Dose 100)
LD50 : Liều của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho 50%
(một nửa) của một nhóm động vật thử nghiệm (Lethal Dose 50)
LOD : Giới hạn phát hiện (Limited of detection)
LOQ : Giới hạn định lượng (Limited of quantification)
MLD : Liều nhỏ nhất gây ra cái chết cá biệt ở động vật thí nghiệm khi thí nghiệm một
nhóm động vật (minimum lethal dose)
MU : Đơn vị chuột (mouse unit)
NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
PSP : Paralytic Shellfish Poisoning (độc tố gây liệt cơ do động vật nhuyễn thể)
ROESY : Rotating frame Overhauser Effect Spectroscopy
SPE : Chiết pha rắn (solid phase extraction)
SRM : Chế độ kiểm soát chuỗi phản ứng (Selected reaction monitoring)
STX : Saxitoxin
TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
TTX : Tetrodotoxin
TTXs : Tetrodotoxin và các dẫn chất (Tetrodotoxin analogues)
UV : Tử ngoại (Ultra violet)
VGSC : Điện thế màng kênh Na (Voltage-Gated Sodium Channel)
VKNTTW : Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
VSV : Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Hàm lượng TTXs trong một số loài động vật biển khu vực Nhật Bản và
Australia [82] ………………………………………………………………………………………………… 10
Bảng 1. 2. Các loài vi khuẩn có khả năng sản sinh tetrodotoxin [150] ………………………… 12
Bảng 1. 3. Sự thay đổi của độc tố ở buồng trứng của cá nóc hổ theo tháng [2] …………….. 14
Bảng 1. 4. Phân bố TTXs trong một số bộ phận cá nóc F. Niphobles [68] ………………….. 14
Bảng 1. 5. Hàm lượng TTXs trong 2 loài cá nóc T. nigroviridis và T. Biocellatu [68] ….. 14
Bảng 1. 6. Tình hình ngộ độc do cá nóc ở Việt Nam từ năm 1999 – 2003 [3] ……………… 17
Bảng 1. 7. Hoạt tính của TTX trong thử tác dụng giảm đau ở sinh vật [118] ……………….. 22
Bảng 1. 8. Tác dụng của TTX trên thời gian sống trung bình …………………………………….. 25
Bảng 1. 9. Một số hãng cung cấp chuẩn TTX ………………………………………………………….. 44
Bảng 2. 1. Bảng chia mức độ độc của cá nóc theo phương pháp sinh hoá chuột [124] ….. 51
Bảng 2. 2. Cách pha dãy các dung dịch chuẩn …………………………………………………………. 52
Bảng 3. 1. Mức độ độc của phủ tạng một số loài cá nóc ……………………………………………. 64
Bảng 3. 2. Khảo sát độ thu hồi của TTX qua cột chiết SCX ………………………………………. 67
Bảng 3. 3. Khảo sát một số điều kiện sắc ký ……………………………………………………………. 72
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống …………………………………………………… 73
Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ……………………………………… 73
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại …………………………………………………………………….. 74
Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát độ thu hồi ……………………………………………………………………. 75
Bảng 3. 8. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc chuột vân bụng ………………………… 77
Bảng 3. 9. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc chuột vân bụng ……………………… 77
Bảng 3. 10. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc tro ………………………………………… 78
Bảng 3. 11. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc tro ……………………………………… 78
Bảng 3. 12. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc vằn……………………………………….. 79
Bảng 3. 13. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc vằn …………………………………….. 79
Bảng 3. 14. Hàm lượng TTX trong gan, trứng của một số loài cá nóc ………………………… 80
Bảng 3. 15. Ký hiệu của các phân đoạn chất phân lập ra từ 05 loài cá nóc độc …………….. 84
Bảng 3. 16. Dữ liệu phổ của TTX và 5 chất phân lập được ……………………………………….. 85
Bảng 3. 17. Các chất độc tetrodotoxin và tương tự tetrodotoxin ………………………………… 91
Bảng 3. 18. Lượng TTX thu được và độ tinh khiết đạt được ……………………………………… 94
Bảng 3. 19. Kết quả định lượng TTX trong mẫu sau khi tinh chế ………………………………. 98
Bảng 3. 20. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng trong TCCS nguyên liệu TTX ………………………. 98
Bảng 3. 21. Hàm lượng TTX trong một số dung môi theo thời gian …………………………… 99
Bảng 3. 22. Kết quá đánh giá đồng nhất lô ……………………………………………………………. 100
Bảng 3. 23. Các thông số của hệ sắc ký ………………………………………………………………… 100
Bảng 3. 24. Kết quả đánh giá liên phòng ………………………………………………………………. 101
Bảng 3. 25. Kết quả đánh giá theo ANOVA ………………………………………………………….. 101
Bảng 3. 26. Tập hợp kết quả của hai PTN ……………………………………………………………… 101
Bảng 3. 27. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng trong TCCS bột đông khô 0,1% ………………….. 103
Bảng 3. 28. Mức liều thử nghiệm trên chuột ………………………………………………………….. 104
Bảng 3. 29. Kết quả thử nghiệm độc tính bột đông khô …………………………………………… 105
Bảng 3. 30. Bảng ngoại suy liều …………………………………………………………………………… 107
Bảng 3. 31. Bố trí thí nghiệm thử độc tính bán trường diễn……………………………………… 107
Bảng 3. 32. Kết quả theo dõi cân nặng thỏ …………………………………………………………….. 108
Bảng 3. 33. Bảng theo dõi các chỉ số huyết học trước thí nghiệm …………………………….. 108
Bảng 3. 34. Bảng theo dõi các chỉ số huyết học giữa thí nghiệm ……………………………… 108
Bảng 3. 35. Bảng theo dõi các chỉ số huyết học sau thí nghiệm ……………………………….. 109
Bảng 3. 36. Bảng theo dõi các chỉ số sinh hoá trước thí nghiệm ………………………………. 109
Bảng 3. 37. Bảng theo dõi các chỉ số sinh hoá giữa thí nghiệm ………………………………… 109
Bảng 3. 38. Bảng theo dõi các chỉ số sinh hoá sau thí nghiệm …………………………………. 110
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Hình ảnh hai trong số các loài cá nóc độc ………………………………………………….. 3
Hình 1. 2. Công thức hoá học của TTX …………………………………………………………………….. 4
Hình 1. 3. Một số dẫn chất của TTX ………………………………………………………………………… 5
Hình 1. 4. Cấu trúc hoá học của các PSPs ………………………………………………………………… 6
Hình 1. 5. Cấu trúc hoá học của saxitoxin (STX) ………………………………………………………. 6
Hình 1. 6. Phân bố độc tố TTX và PSP trong một số loài tự nhiên [80] ………………………… 9
Hình 1. 7. Tetrodotoxin chẹn kênh vận chuyển natri làm tê liệt thần kinh [120] ………….. 19
Hình 1. 8. Mô hình cơ chế hoạt động ức chế cảm giác đau của TTX ………………………….. 21
Hình 1. 9. Sự phát triển số lượng tế bào EAC ở chuột mang ung thư ………………………….. 26
Hình 1. 10. Sơ đồ quy trình phân lập TTX từ loài cá nóc Spheroides rubripe [53] ……….. 28
Hình 1. 11. Tóm tắt tổng hợp theo Kishi [79] ………………………………………………………….. 30
Hình 1. 12. Phân tích sự khác nhau trong sự ngắt mạch nhân cychlorhexan ………………… 32
Hình 1. 13. Tổng hợp TTX từ D-Glucose [138]……………………………………………………….. 32
Hình 1. 14. Phổ hồng ngoại của TTX [156] …………………………………………………………….. 34
Hình 1. 15. Phổ UV-VIS của tetrodotoxin [153] ………………………………………………………. 35
Hình 1. 16. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng TTX, GTX, STX và mẫu chiết T. nigroviridis [90]
……………………………………………………………………………………………………………………. 36
Hình 1. 17. Sắc ký đồ HPLC-FLD định lượng TTX trong huyết tương [96] ……………….. 37
Hình 1. 18. Sắc ký đồ HPLC-FLD của TTXs và dịch chiết cá nóc N. lineata [38] ……….. 37
Hình 1. 19. Một số sắc ký đồ định lượng TTXs trong gan, trứng cá nóc bằng HPLC-FLD
[7] ………………………………………………………………………………………………………………… 38
Hình 1. 20. Phổ khối của dẫn xuất C9 base – trimethylsilyl của độc tố từ sâu băng
Cephalothrix sp. thu được ở vịnh Hiroshima [31] ………………………………………………. 39
Hình 1. 21. Sắc ký đồ phân tích TTXs, mẫu chuẩn TTXs (A) và các mẫu thử F. niphobles
(B), T. nigroviridis (C), T. biocellatu (D) [68] …………………………………………………… 40
Hình 1. 22. Sắc ký đồ và phổ ESI-MS của TTX [154] ……………………………………………… 40
Hình 1. 23. Sắc ký đồ định lượng TTX, (A): mẫu huyết thanh trắng, (B): mẫu huyết thanh
+ TTX 10ng/mlml, (C): cá nóc N. clathrata, (D): mẫu huyết thanh người. [69] ……… 41
Hình 1. 24. TTX tinh khiết cung cấp bởi một số hãng: (a) Enzo – Mỹ;……………………….. 45
Hình 1. 25. Cơ chế epimer hoá OH-C4 của TTX ……………………………………………………. 119
Hình 2. 1. Thiết bị xay ngâm chiết, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW …………………………….. 47
Hình 2. 2. Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu …………………………………………………. 48
Hình 2. 3. Hai loài (1) Cá nóc vàng (L. lunaris) và (2) cá nóc chuột vân bụng (A. hispidus)
……………………………………………………………………………………………………………………. 50
Hình 2. 4. Phủ tạng cá nóc được mổ lấy ra để đem đi xử lí ……………………………………….. 50
Hình 2. 5. Quy tring diễ n …………………………………………….. 62
Hình 3. 1. Tiêu bản 10 loài cá nóc độc ……………………………………………………………………. 63
Hình 3. 2. Sắc ký lớp mỏng (A) và phổ MS (B) của dịch sau khi chiết qua SPE C18 …… 65
Hình 3. 3. Sắc ký lớp mỏng (A) và phổ MS (B) của dịch sau khi chiết qua SPE cột Evidex
……………………………………………………………………………………………………………………. 65
Hình 3. 4. Sắc ký lớp mỏng (A) và phổ MS (B) của dịch sau khi chiết qua SPE cột SCX 66
Hình 3. 5. (A): Sắc ký đồ bản mỏng hệ pha động A: n-butanol, acid acetic khan và nước
(2:1:1); (B): Sắc ký đồ bản mỏng hệ pha động B: pyridin, ethyl acetate, acid acetic và
nước (15:5:3:6); (C): sắc ký đồ khảo sát LOD theo hệ pha động B. ……………………… 68
Hình 3. 6. Phổ ESI MS (A) và phổ ESI MS
2
(B) của TTX chuẩn (1 µg/ml) ………………… 69
Hình 3. 7. Phổ ESI MS (A) và ESI MS
2
(B) của mẫu cá nóc ……………………………………… 70
Hình 3. 8. Phổ HR ESI MS của dung dịch TTX chuẩn 1µg/mL và mẫu thử A. hispidus .. 71
Hình 3. 9. SKĐ phân tích TTX theo chương trình sắc ký (F) …………………………………….. 72
Hình 3. 10. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn TTX nồng độ 2,5µg/mL (a), dung dịch thử (b),
dung dịch trắng (c) và mảnh phổ SRM m/z=320 -> 162 đặc trưng của TTX để định
lượng (d) ………………………………………………………………………………………………………. 73
Hình 3. 11. Đồ thị biểu mối tương quan nồng độ TTX và diện tích píc ………………………. 74
Hình 3. 12. Quy trình chuẩn bị mẫu định lượng TTX từ cá nóc …………………………………. 76
Hình 3. 13. Sơ đồ quy trình chiết TTX và các chất tương tự ……………………………………… 81
Hình 3. 14. Sơ đồ quy trình làm giàu và phân lập nhóm chất TTX và các dẫn chất ………. 82
Hình 3. 15. Phổ khối ESI-MS của mẫu chuẩn TTX 1 µg/ml (A) và của dịch chiết phân
đoạn V2 của 5 loài cá nóc độc (B, C, D, E và F) ……………………………………………….. 83
Hình 3. 16. Cấu trúc của TTX1 và các tương tác HMBC chính …………………………………. 86
Hình 3. 17. Cấu trúc và tương tác HMBC của TTX2………………………………………………… 87
Hình 3. 18. Cấu trúc và tương tác HMBC của TTX4………………………………………………… 89
Hình 3. 19. Quy trình chiết xuất TTX …………………………………………………………………….. 93
Hình 3. 20. Quy trình sơ tinh chế …………………………………………………………………………… 94
Hình 3. 21. Quy trình tinh chế TTX từ TTX thô ………………………………………………………. 96
Hình 3. 22. Phổ khối phân giải cao (HR ESI MS) của hợp chất TTX tinh chế …………….. 97
Hình 3. 23. Sắc ký đồ định lượng TTX, (a) dung dịch chuẩn TTX nồng độ 2,5µg/mL; (b)
dung dịch thử ………………………………………………………………………………………………… 97
Hình 3. 24. Lọ chuẩn tetrodotoxin 0,1 mg trong 1 ml dung dịch đệm citrate ……………….. 99
Hình 3. 25. Bột đông khô tetrodotoxin 0,1% …………………………………………………………. 103
Hình 3. 26. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa liều thí nghiệm và tỷ lệ chết chuột … 105
Hình 3. 27. Hình ảnh mô gan, thận đại diện của từng nhóm thỏ thử nghiệm ……………… 112
Hình 3. 28. Hình ảnh mô gan, thận đại diện của từng nhóm thỏ thử nghiệm ……………… 113
Hình 4. 1. Thiết bị xay, ngâm và chiết: Mô hình và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu… 121
Hình 4. 2. Sơ đồ thiết kế phần ngâm, xay thô và motor điều tốc ………………………………. 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đái Duy Ban (2009) Nghiên cứu sử dụng Tetrodotoxin làm thuốc hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch, ung thư, nghiện ma tuý, nghiện thuốc lá, nghiện rượu và HIV/AIDS, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội,
2. Trần Đáng (2004) “Sự phân bố độc tố cá nóc”. Tạp chí Thông tin y dược, 6, 8-10.
3. Trần Đáng, cs. (2004) Điều tra tình hình các yếu tố liên quan và mô hình can thiệp nhằm kiểm soát ngộ độc thực phẩm do cá nóc, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm,
4. Nguyễn Thị Dụ (2004) “Ngộ độc cá nóc”. Tạp chí y học quân sự, 4, 57-60.
5. Đào Việt Hà, Phạm Xuân Kỳ, Nguyễn Phương Anh, Phan Bảo Vy, Đặng Quốc Minh (2012) Độc tính Tetrodotoxin ở ốc hương Babylonia areolata (Link, 1807) nuôi bằng thức ăn chế biến từ cá nóc độc. Chương trình Hội nghị Khoa học Biển Đông.
6. Vũ Việt Hà, Nguyễn Hoài Nam, Đặng Văn Thi (2005) Hiện trạng nguồn lợi cá nóc ởbiển Việt Nam. Tuyển tập các công trình nghiên cứu nghề cá biển. NXB. Nông nghiệp Hà Nội,
7. Bùi Thị Thu Hiền (2010) Đánh giá kết quả nghiên cứu đã đạt được từ năm 2009-2010 và định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo của đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy chủng vi sinh vật sản sinh Tetrodotoxin (TTX) trong cá nóc độc Việt Nam và tách chiết TTX. Tài liệu hội thảo khoa học.
8. Bùi Thị Thu Hiền (2013) Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam, Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội,
9. Bùi Thị Thu Hiền, Nguyễn Hữu Hoàng, Phạm Quốc Long, Khuất Hữu Thanh (2012) “Nghiên cứu quy trình công nghệ tinh sạch tetrodotoxin từ sinh khối vi khuẩn”. Nông nghiệp và phát triển nông thông, 1 (2), 66-72.
10. Bùi Thị Thu Hiền, Bùi Trọng Tâm, Phạm Quốc Long (2009) “Tetrodotoxin nguồn gốc vi sinh vật và triển vọng ứng dụng trong y dược ở Việt Nam”. Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững, 626-634.
11. Lê Văn Hiệp, Nguyễn Ái Thường, Lâm Thành Hưng, Ngô Phú, Nguyễn Công Bảy (2007) “Bước đầu thử nghiệm tinh chế độc tố cá nóc”. Tạp chí Y học dự phòng, 7 (92), 26-29.
12. Lê Quang Huấn (1996) Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết, tinh chế và đánh giá hàm lượng Tetrodotoxin của một số loài cá nóc (Tetraodontidae) vùng biển miền Trung ở Việt Nam, Luận án Phó Tiến sỹ Khoa học Sinh học, chuyên ngành lý sinh,
13. Lê Quang Huấn, Đái Duy Ban, Phan Xuân Đọc (2010) “Cơ chế phân tử của chếphẩm Bahudo chứa Tetrodotoxin (TTX) dùng trong hỗ trợ giảm đau và cai nghiện ma tuý”. Tạp chí Nghiên cứu y học, 71 (6), 131-134.
14. Lê Quang Huấn, Nguyễn Gia Bình, Đái Duy Ban (2010) “Những thay đổi một sốchỉ tiêu sinh hóa sau khi sử dụng chế phẩm BAHUDO”. Tạp chí Y học Việt Nam, 372 (2), 124-129.
15. Lê Quang Huấn, Lê Xuân Tú (1994) “Tách chiết và tinh chế tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc (Tetraodontidae) tại vùng biển Việt Nam”. Tạp chí Sinh học, 3, 38-41.
16. Nguyễn Văn Lệ (2004) “Nghiên cứu độc tính cá nóc và các giải pháp xử lý, chế biến, quản lý từ khâu khai thác đến khâu tiêu thụ cá nóc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm”. Kỷ yếu hội thảo toàn quốc về khai thác chế biến và dịch vụ hậu cần nghề cá, 256-264. 129
17. Nguyễn Văn Lệ, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Thị Thu Hiền và ctv (2006) “Kết quả phân tích độc tố cá nóc biển Việt Nam”. Tuyển tập Nghiên cứu nghề cá biển, 4, 256-264.
18. Dược điển Việt Nam (2009) Dược điển Việt Nam IV.
19. Nguyễn Hoài Nam, Đặng Văn Thi (2007) “Một số thông tin về cá nóc biển Việt Nam”. Tạp chí Thuỷ sản, 1, tr. 25-28.
20. Đỗ Tuyết Nga, Đào Việt Hà, Phạm Xuân Kỳ, Lưu Thị Hà, Cao Phương Dung (2003) “Xác định độc tố Tetrodotoxin trong một số loài cá nóc thu ở Nha Trang (năm 2001)”. Tuyển tập Nghiên cứu biển, Nha Trang, 13/2003, 215-224.
21. Trần Văn Sung (2002) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân trong hóa hữu cơ, Nxb: Đại học quốc gia Hà Nội,
22. Viên Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2009) Ứng dụng sắc ký lỏng khối phổ trong kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu đào tạo,
23. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2008) Báo cáo tổng thuật đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”. Đề tài cấp Bộ Y tế (2006-2008).
24. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2010) Báo cáo tổng hợp đề tài “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế một số hợp chất đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụkiểm nghiệm dược liệu”. Đề tài cấp nhà nước (MS: KC.10.16/06-10, 2008 – 2010) thuộc Chương trình KHCN trọng điểm cấp nhà nước KC.10/06-10
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất