Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư

by

Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư

Luận án Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư.Thông đỏ(Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bốchủyếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. ỞViệt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng ở độcao từ1.300 m đến 1.700 m với sốlượng cá thểnhỏ. Từlâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này đểtrịhen suyễn, viêm phếquản, nấc, tiêu hoá…; cành và vỏdùng trịbệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trịbệnh đau đầu… Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất có tác dụng ức chếtếbào ung thưnhư: paclitaxel (taxol), cephalomannin hoặc các chất có thểbán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatinIII, deacetyl taxol…. Tuy nhiên, thông đỏlà loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp. Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một bệnh nhân cần sửdụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ60 năm tuổi [125]. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từcây tựnhiên khó đáp ứng đủ nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từcây tựnhiên dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơtiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125]. 

ỞViệt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng rộng rãi thông đỏtại Đà Lạt đểlấy lá sửdụng chiết xuất 10-deacetyl baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện nay, BộKhoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đềtài, dựán vềnghiên cứu chiết xuất phân lập cũng nhưsản xuất thuốc tiêm paclitaxel từnguồn dược liệu thông đỏ ởViệt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc điều trịung thưphục vụcộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệsinh khối tếbào thực vật đểsản xuất các hoạt chất từdược liệu nói chung và thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125]. 

Công nghệsinh khối tếbào thực vật là công nghệnuôi cấy các tếbào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm mục đích tạo ra khối lượng tếbào từ đó có thểsửdụng đểtách chiết các hoạt chất [46], [53]. Công nghệsinh khối tếbào có ưu điểm so với việc gieo trồng ngoài tựnhiên là: thời gian từkhi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn, không chịu ảnh hưởng của các yếu tốngoại cảnh nhưkhí hậu, thời tiết, dịch bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thểđược cải thiện hơn so với trồng ngoài tựnhiên. Công nghệnày rất thích hợp cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong cây tự nhiên. Từcông nghệsinh khối tếbào thực vật, các nhà khoa học đã cung cấp cho thịtrường những sản phẩm có giá trịphục vụcho ngành công nghiệp Dược phẩm và thực phẩm [9], [53]. 

Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từnguồn dược liệu thông đỏ ởViệt Nam theo hướng ứng dụng công nghệsinh khối tếbào thực vật, đềtài: “Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu: 

  1. Xây dựng được qui trình tạo sinh khối tếbào thông đỏqui mô phòng thí nghiệm. 
  2. Xác định được thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một sốchất chính và xây dựng tiêu chuẩn cơsởnguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏtạo ra.a

MỤC LỤC 

Trang

Trang phụbìa 

Lời cảm ơn 

Lời cam đoan 

Mục lục 

Danh mục chữviết tắt trong luận án 

Danh mục các bảng 

Danh mục các hình 

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… ….1 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………………3 

1.1. CÂY THÔNG ĐỎ………………………………………………………………………………………….3 

1.1.1. Tên khoa học . ……………………………………………………………………….3 

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố………………………………………………….3 

1.1.3. Thành phần hóa học ……………………………………………………………….5 

1.1.4. Tác dụng sinh học…………………………………………………………………..9 

1.1.5. Các thuốc điều trịung thưnguồn gốc từthông đỏ………………………9 

1.2. CÔNG NGHỆSINH KHỐI TẾBÀO THỰC VẬT………………………………11 

1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai………………………..11 

1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tếbào thực vật ……………………………………13 

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sựphát triển tếbào và hàm lượng hoạt 

chất trong nuôi cấy tếbào thực vật……………………………………………15 

1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trịung thư……..21 

1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệsinh khối tếbào thực vật ……22 

1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sửdụng trong 

đánh giá chất lượng sinh khối tếbào thông đỏ………………………….. 28 

1.3.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từsinh khối tếbào 

thông đỏ………………………………………………………………………………..29 

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.31 

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊNGHIÊN CỨU ………………….31 

2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất ………………………………………………………..31 

2.1.2. Thiết bịnghiên cứu……………………………………………………………….31 

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………………..32 

2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ……………………………….32 

2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một sốchất 

chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tếbào thông đỏ.36 

2.2.3. Phương pháp phân tích xửlý kết quảnghiên cứu ……………………..41 

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢNGHIÊN CỨU………………………………………………..42 

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾBÀO THÔNG ĐỎ……..42 

3.1.1. Tạo callus thông đỏ………………………………………………………………42 

3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏtrong môi trường thạch …………..48 

3.1.3. Kết quảnuôi cấy trong môi trường lỏng ………………………………….52 

3.1.4. Kết quảnuôi cấy trên hệthống bioreactor 5 lít…………………………64 

3.1.5. Kết quảnghiên cứu thu hoạch sinh khối tếbào thông đỏ…………..65 

3.2. KẾT QUẢNGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT 

PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠSỞCỦA SINH KHỐI TẾBÀO 

THÔNG ĐỎ…………………………………………………………………………………………………………….70 

3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tếbào thông đỏ……70 

3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một sốchất chính trong sinh 

khối tếbào thông đỏ……………………………………………………………….81 

3.2.3. Chiết xuất, tinh chếpaclitaxel trong sinh khối tếbào thông đỏ…..89 

3.2.4. Kết quảnghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơsởcủa nguyên liệu 

sinh khối tếbào thông đỏvà hoạt chất ………………………………………97 

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………………………..104 

4.1.  QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾBÀO THÔNG ĐỎ…………………..104 

4.1.1. Vềnuôi cấy tạo callus thông đỏ……………………………………………104 

4.1.2. Vềduy trì nuôi cấy callus thông đỏtrong môi trường thạch …….108 

4.1.3. Vềnuôi cấy tếbào thông đỏtrong môi trường lỏng ………………..111 

4.1.4. Vềnuôi cấy tếbào thông đỏtrên hệthống bioreactor 5 lít……….124 

4.1.5. Vềquy trình thu hoạch sinh khối tếbào thông đỏ…………………..126 

4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN 

LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠSỞCỦA SINH KHỐI TẾBÀO 

THÔNG ĐỎ…………………………………………………………………………………………………………126 

4.2.1. Vềnghiên cứu thành phần hóa học ……………………………………….126 

4.2.2. Vềchiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh 

khối tếbào thông đỏ……………………………………………………………..129 

4.2.3. Vềchiết xuất, tinh chếpaclitaxel trong sinh khối tếbào thông đỏ130 

4.2.4. Vềkết quảxây dựng TCCS của sinh khối tếbào thông đỏ………133 

KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………….135 

KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………………………137 

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐLIÊN 

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ……………………………………………………………………..138 

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………139 

PHẦN PHỤLỤC……………………………………………………………………………….155

CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 

  1. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Nguyễn Tùng Linh(2008), “Nghiên cứu quy trình tạo callus thông đỏViệt Nam (Taxus wallichiana)”, Tạp chí Dược học, 9, tr. 24-27. 
  2. VũBình Dương, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Nguyễn Tùng Linh(2010), “Nghiên cứu duy trì nuôi cấy tếbào thông đỏ Việt Nam trên môi trường thạch”,Tạp chí Y Dược học quân sự, 6, tr. 26-30.
  3. Vũ Bình Dương, Nguyễn Tùng Linh, Nguyễn Văn Long, Đào Văn Đôn, Phạm ThịThanh Hà, Phan Đình Châu(2010), “Nghiên cứu định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tếbào thông đỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí khoa học và công nghệ,48(6A), tr. 55-61.
  4. VũBình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm Văn Hiển, Chử Đức Thành(2011), “Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối tếbào thông đỏViệt Nam trong môi trường lỏng”,Tạp chí Y Dược học quân sự, 8, tr. 7-14.
  5. VũBình Dương, Trịnh Nam Trung, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương(2011), “Phân lập paclitaxel và một dẫn chất của taxuyunnanine C từsinh khối thông đỏViệt Nam (Taxus wallichianaZucc)”, Tạp chí Dược học, 11, tr. 52-55.
  6. Phan Đình Châu, VũBình Dương(2011), “Sản xuất thuốc điều trịung thưpaclitaxel từcác loài thông đỏbằng công nghệsinh khối tếbào thực vật”, Tạp chí thông tin Y Dược học, 8 và 9, tr. 12-15 và 7-10.139 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

Tiếng Việt 

  1.  BộY tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, trang PL. 127-129 và tr. PL182-183. 
  2.  BộY tế (2010), Dược thưquốc gia, Nhà xuất bản Y học, tr.121-128 và trang 245-258.
  3.  ĐỗHuy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và cộng sự(2009), Cây thuốc và động vật làm thuốc ởViệt Nam, Nhà xuất bản khoa học – kỹthuật,2, tr. 897-900.
  4.  VũBình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương (2010), “Nghiên cứu định lượng acid 1 naphtalenacetic trong sinh khối sâm ngọc linh bằng HPLC”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự, 7, tr.7-11.
  5.  Nguyễn Công Hào, Nguyễn ThịDiệu Thuần, Hồng Thị  Đức, Nguyễn Đình Trung (2002), “Một sốkết quảnghiên cứu vềcây thông đỏ(Taxus wallichiana Zucc,)”, Kỷyếu hội thảo hóa học các hợp chất thiên nhiên với YHCT.
  6.  Vương Chí Hùng (2010), Nghiên cứu quy trình công nghệtách chiết hoạt chất sinh học từlá cây thông đỏvà dừa cạn Việt Nam phục vụsản xuất thuốc chống ung thưvà xuất khẩu, Báo cáo tổng kết đềtài cấp nhà nước – Mã sốKC.10.01/06.10.
  7.  Nguyễn Văn Long (2010), Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tếbào và đánh giá một sốtác dụng sinh học của sâm Ngọc Linh sinh khối, Luận án Tiến sỹy học, Học viện Quân y, Hà Nội.
  8.  Nguyễn Văn Long, VũBình Dương, Đào Văn Đôn (2010), “Nghiên cứu chất kích thích sinh tổng hợp ginsenosid trong nuôi cấy tếbào rễsâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)”, Tạp chí y dược học quân sự, 35(5), tr. 18-23.  140 
  9.  Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Lê Bách Quang, VũBình Dương (2008),“Công nghệsinh khối tếbào thực vật, hướng mới trong sản xuất nguyên liệu làm thuốc”, Tạp chí thông tin Y dược học,12, tr.6-9.
  10.  Trần Công Luận, Ngô Thiện Tú Khanh, Phan Văn Đệ, Vương Chí Hùng (2008), “Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của lá thông đỏ(Taxus wallichianaZucc.) trồng ởLâm Đồng”, Tạp chí y học Thành phốHồChí Minh,12, tr. 98 – 104.
  11.  Hoàng Văn Lương, VũBình Dương (2009), “Các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độphát triển và hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tếbào thực vật”, Tạp chí Y dược học Quân sự, 6, tr.5-11.
  12.  Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nguyễn Công Hào, Châu Văn Minh (2007), “Sựbiến động của hàm lượng 10 deacetyl baccatin III, 19 hydroxy baccatin III theo thời gian thu hái trong lá cây thông đỏ(Taxus wallichianaZucc.) ởtỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Sinh học, 29(4), tr.49-51.
  13.  Lê Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, Trần Văn Minh (2006), “Tìm hiểu sựtăng trưởng của dịch treo tếbào thông đỏ(Taxus wallichianaZucc.)”, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, 9 (5), tr. 47-51.
  14.  Nguyễn Ngọc Song Trâm, Bùi ThếVinh, Nguyễn Hoàng Quỳnh Hương, Trần Công Luận (2008), “Xây dựng quy trình định lượng 10-DAB và taxol trong lá thông đỏ(Taxus wallichiana Zucc.)”, Tạp chí Y học thành phốHồChí Minh,12(4), tr. 105-111.
  15.  Viện dược liệu – BộY tế (2008), Phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 10-20.

Leave a Comment