Nghiên cứu sản xuất insulin tái tổhợp Giai đoạn 1:Thiết kếvector và chọn tếbào biểu hiện Insulin

Đái tháo đường là bệnh được quan tâm từ lâu trên toàn thế giới vì gánh nặng cho gia đình và xã hội mà nó gây ra.

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 263 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và con số này tiếp tục tăng lên. Ước tính đến năm 2025, con số này sẽ lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên (so với hiện nay) ở các nước phát triển là 42%, nhưng ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) có thể sẽ là 170% trong vòng 30 năm tới [1].

Ở Mỹ, có khoảng 14 triệu người mắc bệnh đái tháo đường; hàng năm, 250.000 bệnh nhân đái tháo đường chết vì các biến chứng của bệnh này. Ở Singapore, tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng lên theo thời gian: năm 1975 là 1,9%; 1984 là 4,7%; 1992 là 8,6% [2].

Ở nước ta, theo Tạ Văn Bình và cộng sự [3], tỷ lệ mắc bệnh chung trên cả nước là 2,7%; như vậy, có khoảng 2,3 triệu bệnh nhân đang mắc đái tháo đường, con số này còn tăng lên đồng hành với sự tăng trưởng kinh tế và những thay đổi về lối sống và các điều kiện sống.

Đặc điểm của bệnh đái đường (đặc biệt là týp 1) là phải dùng Insulin hàng ngày và phải dùng suốt đời. Với tỷ lệ đái tháo đường như hiện nay, hàng năm cả nước phải chi một số tiền không nhỏ cho việc mua insulin (khoảng 11.000 tỷ đồng), chưa kể tiền điều trị nhiều biến chứng của nó. Ở nước ta hiện nay, toàn bộ insulin đều phải nhập ngoại; vì vậy, nếu tự sản xuất được trong nước, giá thành thuốc sẽ hạ và điều đó mang lại ý nghĩa kinh tế và xã hội không nhỏ.

Insulin là thuốc đầu tiên sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp gen được dùng cho người từ năm 1978. Nguyên lý của công nghệ này, cho đến nay, không có gì thay đổi nhưng bản quyền và các chi tiết kỹ thuật đều được bảo hộ bởi các Công ty hoặc cơ sở nghiên cứu lớn; các nước muốn phát triển công nghệ sản xuất insulin của riêng mình đều phải tự làm lấy từ đầu.

Vì những lý do trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu này, là bước khởi đầu, với hy vọng có thể sản xuất được insulin trong nước trong tương lai gần, đáp ứng nhu cầu đang tăng lên của xã hội.

Nghiên cứu này nhằm mục đích: 1) thiết kế vector biểu hiện insulin và 2) chọn tế bào biểu hiện insulin.

Nội dung Trang Đặt vấn đề 5

Chương 1: Tổng quan 6

1. Tình hình mắc bệnh đái tháo đường 6

2. Insulin 7

Lịch sử phát hiện 7

Cấu trúc phân tử 9

Quá trình hình thành insulin trong cơ thể 10

Cơ chế tác động của insulin 11

Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 13

Nhu cầu insulin hiện nay 16

Pre-proinsulin và Proinsulin 18

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

1. Proinsulin 21

1.1. Vật liệu 21

1.2. Phương pháp 22

1.2.1. Khuếch đại gen proinsulin 22

1.2.2. Tạo vector mang gen proinsulin 22

1.2.3. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid tái tổ hợp 22

1.2.4. Tuyển chọn thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự gen 22

1.2.5. Cảm ứng biểu hiện và phân tích bằng SDS-PAGE 23

1.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp và nhận dạng bằng Western blot 23

2. Đối với insulin: chuỗi A, B 23

2.1. Vật liệu 24

2.2. Hoá chất 26

2.3. Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1. Tách chiết và tinh sạch plasmid 26

2.3.2. Tạo plasmid tái tổ hợp 27

2.3.3. Phương pháp đọc trình tự 27

2.3.4. Phương pháp biểu hiện protein 28

2.3.5. Phương pháp phân tích và nhận dạng protein bằng khối phổ 28

2.3.6. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Ni- NTA 29

2.3.7. Phương pháp cắt loại bỏ đuôi His Tag 29

3. Các tế bào biểu hiện 29

3.1. Vật liệu 29

3.2. Phương pháp 29 

Chương 3. Kết quả 30

1. Proinsulin 30

2. Chuỗi A, chuỗi B 32

3. Kết quả tế bào biểu hiện 44

Chương 4: Bàn luận 45

Kết luận 47

Kiến nghị 47

Tài liệu tham khảo 48