Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh
Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh.Trong những năm gần đây, vai trò của các cytokin tiền viêm trong các đáp ứng miễn dịch ngày càng được quan tâm, hầu hết các phương pháp điều trị chống viêm mới đều hướng đến mục tiêu điều hòa mức độ các cytokin này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, nồng độ interleukin 6 (IL6) trong máu tăng cao là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh Crohn, viêm khớp dạng thấp (RA), suy hô hấp cấp trong COVID-19 và ung thư. Các liệu pháp điều trị bằng thuốc sinh học là các kháng thể đơn dòng có khả năng ức chế đường truyền tín hiệu của IL6 như tocilizumab, salirumab, olokizumab đã và đang được phát triển.
Trong bệnh lý viêm, IL6 đóng vai trò quyết định trong sự chuyển đổi từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính bằng cách thay đổi bản chất sự tập trung bạch cầu tại ổ viêm từ bạch cầu trung tính đa nhân thành bạch cầu đơn nhân/đại thực bào.3 Ngoài ra, IL6 còn có tác dụng kích thích lên tế bào T và B, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng viêm mạn tính. Đường truyền tín hiệu của IL6 được hình thành khi IL6 kết hợp với thụ thể đặc hiệu IL6R dạng hòa tan tại vị trí I và thụ thể truyền tin glycoprotein130 (gp130) tại vị trí IIIa, từ đó kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng như JAK/STAT và gây ra các bệnh lý liên quan.4,5 Trong bệnh lý ung thư, cytokin này được xác định như một dấu ấn sinh học ung thư thông qua việc sàng lọc các chất trung gian gây viêm.6 Khi đường truyền tín hiệu IL6/JAK/STAT3 tăng hoạt động một cách bất thường dẫn đến thúc đẩy sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn và di căn của các tế bào, đồng thời ngăn chặn phản ứng miễn dịch chống khối u.7 Thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tác động đến đường truyền tín hiệu IL6, cụ thể là vị trí tương tác giữa IL6 với IL6R (vị trí I) và gp130 (vị trí IIIa), các nhà nghiên cứu hướng tới cải thiện kết quả điều trị của bệnh nhân ung thư bằng cách tăng cường các đáp ứng hướng đích hiệu quả.8 Có thể thấy rằng, chiến lược điều trị viêm và ung thư nhắm vào mục tiêu IL6 là hữu hiệu, đặc biệt là hướng phát triển các thuốc có cấu trúc phân tử nhỏ sử dụng đường uống đang trở thành hướng nghiên cứu tiềm năng.
Trên đường truyền tín hiệu của IL6, các thế hệ thuốc cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6 thông qua ức chế các janus kinase (JAKs) như tofacitinib, ruxolitinib, baricitinib hay ức chế gp130 như bazedoxifen, raloxifen đã được phát triển,9 nhưng vẫn chưa có chất phân tử nhỏ nào ức chế thông qua gắn kết trực tiếp lên IL6 hoặc IL6R được công bố. Đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở thử nghiệm in vitro. Nguyên nhân có thể do các nghiên cứu trước thiếu thông tin về cấu trúc protein mục tiêu hoặc chọn protein không phù hợp, cũng như việc đánh giá ái lực gắn kết protein- phối tử chưa được chú trọng.10-12 Độc tính cũng như việc không thỏa các tiêu chí dược động học có thể là một trong những rào cản lớn cho các thuốc phân tử nhỏ. Sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc protein mục tiêu kết hợp thử nghiệm lý sinh trên in vitrochính là nền tảng cho nghiên cứu tìm kiếm các các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6. Bên cạnh đó, việc dự đoán các đặc tính dược động học giúp giảm thiểu được rủi ro cho các bước thử nghiệm tiền lâm sàng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí cho nghiên cứu.
Hiện nay, các cấu trúc 3D protein dạng đơn lẻ và phức hợp của IL6, IL6R đã được xác định và công bố trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein databank – RCSB), theo đó mô hình hóa về sự tương tác giữa các protein này cũng ngày càng sáng tỏ.10-12 Thêm vào đó, sự phát triển của các thư viện cấu trúc phân tử nhỏ khiến cho hướng thiết kế thuốc ức chế IL6 dựa trên cấu trúc trở nên tiềm năng. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu trước đây của Li,13Zhou14và Sato15 chỉ mới dừng lại ở giai đoạn docking, chưa tiến hành phân tích chi tiết tương tác linh động giữa protein-phối tử bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử hoặc không tiến hành dự đoán các đặc tính dược động học cho thuốc phân tử nhỏ dùng đường uống như nghiên cứu của Sharma,16điều này cũng có thể trở thành trở ngại lớn cho các thử nghiệm in vitro, in vivo.Vì vậy, để lấp đầy các khoảng trống của các nghiên cứu trước, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu “Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh”, tập trung vào các nội dung cụ thể như sau:
1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu
2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp
IL6/IL6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6.
3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT- THUẬT NGỮ ANH-VIỆT v
DANH MỤC BẢNG x
DANH MỤC HÌNH xii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Interleukin 6 và đường truyền tín hiệu 3
1.2. Thiết kế thuốc in silico 19
1.3. Các phương pháp thử nghiệm lý sinh đánh giá khả năng gắn kết IL6, IL6R và
phối tử 27
1.4. Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư 32
1.5. Các nghiên cứu liên quan 33
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1. Thiết kế nghiên cứu 36
2.2. Đối tượng nghiên cứu 37
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42
2.4. Phương pháp nghiên cứu và công cụ đo lường 42
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 55
3.1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu 55
3.2. Đánh giá in vitrocác chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp
IL6/IL6R, khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6 74
3.3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IlIa từ các ngân hàng dữ liệu 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 93
4.1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ
liệu 93
4.2. Đánh giá in vitrocác chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp
IL6/IL6R, khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6 110
4.3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu 123
KẾT LUẬN 131
KIẾN NGHỊ 133
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 134
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Bảng 1.1. Các acid amin nằm ở bề mặt tương tác của phức hợp IL6/IL6R/gp130 12
Bảng 1.2. Các thuốc nhắm mục tiêu IL6/IL6R/gp130 và các giai đoạn phát triển lâm sàng …. 18
Bảng 1.3. Các nghiên cứu liên quan đến đích tác động IL6, IL6R và gp130 34
Bảng 2.1. Thông tin cấu trúc phức hợp IL6 với thụ thể IL6R và kháng thể trên RCSB PDB . 37 Bảng 2.2. Phần mềm được sử dụng trong nghiên cứu 41
Bảng 3.1. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 với IL6R tại vị trí I 55
Bảng 3.2. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 và 6F82 tại vị trí 1 57
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc các chất gắn kết IL6, IL6R qua các mô hình 3D-pharmacophore và mô hình gắn kết docking phân tử tại vị trí 1 60
Bảng 3.4. Điểm số docking chéo của các chất gắn kết IL6 và IL6R tiềm năng tại vị trí 1 62
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá các thông số dược động học ADMET của 23 chất không đáp ứngcác đặc tính của thuốc phân tử sử dụng đường uống bằng công cụ SwissADME và pkCSM. 63Bảng 3.6. Giá trị trung bình của RMSD protein, RMSD phối tử, SASA và Rg được tính toántừ dữ liệu quỹ đạo MD 100 ns của IL6 tại vị trí I ở dạng apoprotein và các phức hợp phối tử.
66
Bảng 3.7. Giá trị trung bình của RMSD protein, RMSD phối tử, SASA và Rg được tính toán từ dữ liệu quỹ đạo MD 100 ns của IL6R ở dạng apoprotein và các phức hợp phối tử 70
Bảng 3.8. Tỷ lệ liên kết hydro giữa các phối tử với các “điểm nóng” tại khoang gắn kết IL6R 71
Bảng 3.9. Năng lượng tự do gắn kết của 15 phối tử tiềm năng với IL6R tại khoang gắn kết.. 73 Bảng 3.10. Giá trị % ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của 13 chất ở nồng độ 100 pM 75
Bảng 3.11. Giá trị % ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của 6 chất tiềm năng ở nồng độ 75
Bảng 3.12. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên 2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 và Hu7 theo thời gian 48 và 72 giờ 77
Bảng 3.13. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên dòng tế bào ung thư LNCaP theo thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ 77
Bảng 3.14. Tỷ lệ tế bào tăng sinh dưới tác động hoạt hóa của IL6 trên dòng tế bào ung thư SW480 và HT29 theo thời gian 24 và 48 giờ 77
Bảng 3.15. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của 13 chất ức chế ở nồng độ 10 pM 78
Bảng 3.16. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của 8 chất “tinib” ở nồng độ 0,1 pM 79
Bảng 3.17. Tỷ lệ tế bào HT-29 sống dưới tác động của baicalin và chrysin ở nồng độ 100 pM 79Bảng 3.18. Tương tác giữa các acid amin quan trọng của IL6 và Olokizumab tại vị trí IlIa… 82Bảng 3.19. Kết quả sàng lọc các thư viện chất qua các mô hình pharmacophore và gắn kếtdocking phân tử tại khoang gắn kết IL6 84
Bảng 3.20. Điểm số docking của các chất gắn kết tốt nhất lên IL6 ở vị trí IIIa 86
Bảng 3.21. Kết quả đánh giá các thông số dược động học ADMET của 24 chất không đáp ứng các tiêu chí của thuốc phân tử nhỏ sử dụng đường uống bằng công cụ SwissADME và pkCSM 87
Bảng 3.22. Tỷ lệ liên kết H giữa 6 phối tử tiềm năng với các acid amin quan trọng của IL6 tại vị trí IIIa trong mô phỏng MD 100 ns 90
Bảng 4.1. Tóm tắt các mô hình 3D-pharmacophore được truy vấn dựa trên PPIs trong các nghiên cứu trước và trong nghiên cứu này 95
Bảng 4.2. Tóm tắt các mô hình docking nhằm tìm kiếm các chất ức chế IL6, IL6R được công bố trong các nghiên cứu trước và trong nghiên cứu này 99
Bảng 4.3. Kết quả đánh giá khả năng gắn kết quercetin với IL6R tại vị trí I qua các mô hình sàng lọc in silico 109
Bảng 4.4. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá IC50 dựa trên Kit thử nghiệm ELISA cạnh tranh của các nghiên cứu trước và nghiên cứu này 111
Bảng 4.5. Tóm tắt các nghiên cứu tăng sinh tế bào LNCaP, HepG2, Hu7, SW480 và HT-29 qua trung gian IL6 ngoại sinh ở các nghiên cứu trước và nghiên cứu này 114
Bảng 4.6. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế của imatinib trên các dòng tế bào khác nhau và trong nghiên cứu này 117
Bảng 4.7. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế của dacomitinib trên các dòng tế bào khác nhau và trong nghiên cứu này 119
Bảng 4.8. Tóm tắt các nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào của quercetin trên các nghiên cứu khác và nghiên cứu này 121
Bảng 4.9. Tóm tắt các mô hình docking nhằm tìm kiếm các chất ức chế IL6 tại vị trí IlIa được công bố trong nghiên cứu của Li và trong nghiên cứu này 125
Bảng 4.10. Kết quả đánh giá gắn kết ZINC01183742 với IL6 tại vị trí IIIa qua các mô hình sàng lọc in silico 129
DANH MỤC HÌNH
Hình
Hình 1. 1. Sự kết hợp giữa interleukin họ IL6 với thụ thể đặc hiệu và thụ thể chung gp130 3
Hình 1.2. Chức năng sinh học của interleukin 6 đối với các tế bào liên quan 4
Hình 1.3. Cấu trúc không gian ba chiều IL6 (A) và vị trí tương tác của IL6 với thụ thể (B) 5
Hình 1.4. Cấu trúc 2D vùng ngoại bào IL6R (A) và các vị trí tương tác tương ứng (B) 6
Hình 1.5. Cơ chế tạo thành sIL6R từ mIL6R và các ghép nối thay thế mRNA 7
Hình 1.6. (A) Cấu trúc 2D của gp130, (B) miền tương tác của gp130 với các cytokin họ IL6 .. 8
Hình 1.7. Các con đường tín hiệu khác nhau được kích thích bởi IL6 10
Hình 1.8. Quy trình thiết kế thuốc in silico 19
Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của bộ KIT thử nghiệm HTRF® ức chế tương tác IL6/IL6R. . 28
Hình 1.10. Nguyên lý hoạt động của Kit thử nghiệm gắn kết RayBio® IL6/IL6R 32
Hình 1.11. Quá trình khử hóa MTT thành formazan 33
Hình 1.12. Cấu trúc 2D của 8 chất ức chế IL6/IL6R/gp130 từ các nghiên cứu liên quan 35
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 36
Hình 2.2. Cấu trúc 3D phức hợp IL6 với thụ thể và kháng thể. (A) Phức hợp IL6 /IL6R/VHH6(PBD ID: 5FUC), (B) Phức hợp IL6/6F82 (PDB ID: 4ZS7), (C) Phức hợp IL6/Olokizumab
(PDB ID: 4CNI) 38
Hình 2.3. Quy trình mô phỏng động lực học phân tử 47
Hình 2.4. Phần trăm ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R 51
Hình 2.5. Sự tăng sinh tế bào sống trong thử nghiệm MTT 52
Hình 3.1. Các mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa trên PPIs được ánh xạ trên các
cấu trúc IL6 (Ph-IL6-1a, A) và IL6R (Ph-IL6R, B) 56
Hình 3.2. Mô hình 3D-pharmacophore (Ph-IL6-1b) dựa trên PPIs với kháng thể 6F82 được
ánh xạ lên cấu trúc IL6 57
Hình 3.3. Mô hình gắn kết docking phân tử cho chất gắn kết IL6 tại vị trí I (A) dựa trên tương
tác với IL6R (D-IL6-1a, B) và với kháng thể 6F82 (D-IL6-1b, C) 58
Hình 3.4. Mô hình gắn kết docking phân tử cho chất gắn kết IL6R (D-IL6R) tại vị trí I 59
Hình 3.5. Tỷ lệ phân bố điểm số docking của 3 CSDL DB, ZINC15 và NCI trên 3 mô hình gắn kết docking phân tử (D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R) 60
Hình 3.6. Phân tích PLIF cho các chất DB, ZINC15và NCI qua 3 mô hình gắn kết docking phân tử (D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R) 61
Hình 3.7. Cấu trúc 2D của 28 chất tiềm năng tương tác tại khoang gắn kết IL6 64
Hình 3.8. Biểu đồ RMSF của các phối tử với IL6a (a1, a2, a3) và IL6b 67
Hình 3.9. Tỷ lệ liên kết hydro giữa 38 phối tử với các acid amin quan trọng tại khoang gắn kết của IL6 ở vị trị 1 68
Hình 3.10. Năng lượng tự do gắn kết giữa 23 phối tử tiềm năng với IL6 tại vị trí I 69
Hình 3.11. Biểu đồ RMSF của các phối tử với IL6R 71
Hình 3.12. Tương tác giữa 15 phối tử tiềm năng với các “điểm nóng” của IL6R 72
Hình 3.13. Kết quả sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu 74
Hình 3.14. Biểu đồ IC50 ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R của quercetin, dabigatran và dacomitinib 76
Hình 3.15. Tỷ lệ tế bào sống (TBS2) khi có 6 chất ức chế imatinib, dacomitinib, entospletinib,dabigatran, quercetin, rhamnetin được hoạt hóa bởi IL6. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê sovới đối chứng với *P<0,05; ** P <0, 01;*** P <0,001;**** P<0,0001 80
Hình 3.16. Tỷ lệ tế bào sống (TBS3) khi có 6 chất ức chế imatinib, dacomitinib, entospletinib,dabigatran, quercetin, rhamnetin và không được hoạt hóa bởi IL6. Sự khác biệt có ý nghĩathống kê so với đối chứng với *P<0,05; ** P <0,01;*** P <0,001;**** P<0,0001 81
Hình 3.17. Các mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng dựa trên PPIs với chuỗi nặng (Ph- IL6-3a1, A) và chuỗi nhẹ (Ph-IL6-3a2, B) của Olokizumab ánh xạ trên các cấu trúc IL6 83
Hình 3.18. Mô hình gắn kết docking phân tử cho chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa 84
Hình 3.19. Phân bố điểm số docking (A) và phân tích tỷ lệ tương tác protein-phối tử (PLIF) (B) giữa các phối tử với các “điểm nóng” tại khoang gắn kết 85
Hình 3.20. Biểu đồ RMSD của IL6 ở dạng tự do (apo) và phức hợp với 17 phối tử tiềm năng.
88Hình 3.21. Biểu đồ RMSF của IL6 ở dạng tự do (apo) và phức hợp với 17 phối tử tiềm năng.
89Hình 3.22. Sơ đồ tương tác chi tiết của các nhóm cấu trúc trong phối tử với các acid amlnquan trọng của IL6. Trong đó, các hình A, B, C, D lần lượt tương ứng với DB00619,
DB15187, ZINC13348421 và ZINC01182742 91
Hình 3.23. Biểu đồ năng lượng tự do gắn kết giữa IL6 và 4 phối tử tiềm năng 92
Hình 3.24. Kết quả sàng lọc in silico chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu 92
Hình 4.1. Ánh xạ của 3 chất DB gắn kết tiềm năng trong 3 mô hình gắn kết docking phân tử
lên 3 mô hình pharmacophore 98
Hình 4.2. Biểu đồ dao động RMSD_protein của 12 phức hợp protein-phối tử tiềm năng có
biên độ dao động thấp nhất 102
Hình 4.3. Biểu đồ dao động RMSD_phối tử của 4 phức hợp protein-phối tử tiềm năng có biên
độ dao động thấp nhất 103
Hình 4.4. Cấu trúc 2D của 8 hợp chất hàng đầu gắn kết tiềm năng với IL6 tại vị trí I trong mô
MD 100 ns mô phỏng 104
Hình 4.5. Cấu trúc 2D của 8 phối tử không tương tác được với các acid amin quan trọng trong
khoang gắn kết của IL6R tại vị trí 1 105
Hình 4.6. Cấu trúc 2D của 4 hợp chất DB14726, DB11986, quercetin và chrysin cho tương tác tốt nhất với IL6R tại khoang gắn kết vị trí I trong mô phỏng MD 100 ns 106
Hình 4.7. Cấu trúc 2D được tối ưu hóa của phối tử có thể cho tương tác tốt với các acid amin
quan trọng tại khoang gắn kết của IL6R 107
Hình 4.8. Cấu trúc 2D của dacomitinib và hình ảnh tương tác tại khoang gắn kết IL6R 112
Hình 4.9. Cấu trúc 2D và hình ảnh tương tác của entospletinib tại khoang gắn kết IL6, IL6R. 118
Hình 4.10. Tương tác protein-protein giữa IL6 và kháng thể Olokizumab. (A) Cấu trúc tinhthể tia X của phức hợp Olokizumab/IL6 và các vị trí gắn kết. (B) và (C) Các acid amin quantrọng của IL6 (màu đỏ) và chuỗi nặng (xanh lam) và chuỗi nhẹ (màu xám) của Olokizumab.
123
Hình 4. 11. Ánh xạ của 3 chất NCI, ZINC15, DB tiềm năng của mô hình gắn kết docking
phân tử D-IL6-3a lên mô hình 3D-pharmacophore Ph-IL6-3a1 124
Hình 4.12. Cấu trúc 2D của 4 chất tiềm năng trong tương tác với các acid amin quan trọng của
IL6 tại vị trí IIIa trong mô phỏng MD 100 ns 127
Nguồn: https://luanvanyhoc.com