Nghiên cứu so sánh các kỹ thuật xác định hoạt tính tái tổ hợp gen trong quá trình tổng hợp kháng thể

Tại hệ miễn dịch,  sự biến đổi về thông tin di truyền diễn ra trong suốt quá trình biệt hóa của tế bào lympho. Quá trình tạo kháng thể gồm hai giai đoạn  kế tiếp nhau: I) Giai đoạn  không phụ thuộc kháng nguyên vμ tế bào  lympho T. Giai đoạn này xảy ra ở gan bμo thai và tủy xương, được lập trình và điều hòa nghiêm ngặt bởi các cytokine. Kết quả của quá trình này là tổ hợp gen mã hóa của IgM đ-ợc thiết lập. II) Giai đoạn kế tiếp là giai đoạn phụ thuộc kháng nguyên và tế bào  lympho T. Giai đoạn này xảy ra ở tổ chức lympho ngoại vi [2, 3]. Hai quá trình biến đổi gen tổng hợp kháng thể xảy ra ở giai đoạn này bao gồm: quá trình tái tổ hợp gen (class switch recombination/CSR)  và quá trình siêu  đột biến (somatic hypermutation/SHM). Tái tổ hợp gen thay thế gen CH của gen quy định IgM (Cỡ) bằng các gen Có, Cồ hoặc Cỏ (tương  ứng với các gen quy định tổng hợp IgG, IgE và IgA). Nhờ sự biến đổi gen này mà  tế bào  lympho B đang tổng hợp IgM chuyển sang tổng hợp IgG, IgE hoặc IgA mμ không thay đổi tính đặc hiệu kháng nguyên. Trong khi đó quá trình siêu đột biến lại xảy ra trên gen V của chuỗi nặng (H chain) vμ chuỗi nhẹ (L chain) [2, 3]. Siêu đột biến tạo ra các đột biến điểm với số lượng cao đến hàng  triệu lần so với số đột biến xảy ra trên gen của các dòng tế bào ngoài hệ miễn dịch. Nhờ sự đột biến chọn lọc này mà thế hệ kháng thể mới có tính đặc hiệu cao hơn với kháng nguyên đã  được  tổng hợp. Enzym activation-induced cytidine deaminase (AID) xúc tác phản ứng loại bỏ gốc amine để chuyển cytidin thành uracin là cầu nối duy nhất  của hai quá trình tái tổ hợp gen và siêu đột biến [3, 4]. Việc đánh giá hoạt tính tái tổ hợp gen cũng như khả năng siêu đột biến trong tế bào lympho B có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá khả năng tổng hợp các dòng kháng thể. Quá trình siêu đột biến thường  được xác định bằng kỹ thuật  giải trình tự các vùng gen đặc hiệu trong khi việc xác định hoạt  tính của quá trình tái tổ hợp gen thì khó khăn hơn vμ các kỹ thuật  cũng đa dạng hơn. Chính   vì lý do đó, trong nghiên cứu này  tác  giả thử nghiệm vμ  so sánh các phương pháp  trực tiếp hoặc gián tiếp xác  định hoạt  tính tái tổ hợp gen khác nhau thông qua AID nhằm mục tiêu:

I. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáp

1. Vật Liệu

Gen AID bình thường vμ đột biến được phân lập và  tách dòng  từ  tế  bào  lympho  của  người  bình thường và bệnh nhân mắc hội chứng tăng IgM bẩm sinh type 2 (HIGM2). Dòng tế bμo sợi mang cơ chất tái tổ hợp gen, chuột AID-/- nhận  được từ Gs. Honjo T. (Khoa Y, Đại học Tổng Hợp Kyoto). Các hóa chất dùng để chuyển gen được mua từ Roche. Hóa chất cho phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) vμ tổng hợp chuỗi ng-ợc (RT-PCR)  mua từ Perkin-Elmer. Hóa chất  phân lập, nuôi cấy và hoạt hóa tế bào lympho B từ Sigma vμ GIBCO. Các kháng thể đặc hiệu được gắn với biotin, allophycocyanin được mua từ PharMingen.