Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

Luận án tiến sĩ sinh học Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Dới rất Da dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược…. Trong Dó vi tảo với ưu Diểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, không Dộc, có tốc Dộ sinh trưởng cao và sức chống chịu cao với những Diều kiện khắc nghiệt của môi trường, Dược coi là mắt xích Dầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và Dộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa Da nối Dôi (polyunsaturated fatty acid – PUFA)….Dặc biệt là squalene.Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Dộng, thực vật thường Dược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học. Squalene Dược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Dã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Dộng vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt Dộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Dã Dược chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Dáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy, chúng cũng Dược dùng phổ biến trong dược phẩm.

Cho Dến nay, các nguồn sản xuất squalene Dược biết Dến nhiều nhất là các loại dầu Dộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Dến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Dến nguồn khai thác squalene Dang dần cạn kiệt. Trong khi Dó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm Dang ngày càng tăng.
Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống Dể tách chiết squalene là rất cần thiết và Dang Dược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Dó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô2 lớn. Gần Dây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids Dược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong Dó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Dược bắt Dầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban Dầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Dược các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Dược Diều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có Dược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo Dảm an toàn cho sử dụng theo Dịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Đề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
– Sàng lọc và xác Định Dược Diều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng
Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Dược cho sản
xuất squalene.
– Xác Dịnh Diều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối
chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Dược; Dánh giá Dộ an toàn và tác dụng sinh học,
dược lý của squalene tách chiết Dược theo Dịnh hướng làm nguyên liệu cho thực
phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
– Sàng lọc Dược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam
– Tối ưu Diều kiện nuôi cấy Dể thu Dược sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Dược ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít.
– Tối ưu Diều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn Dược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác Dịnh Dộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Dược.
– Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm Dộc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình Dộng vật thực nghiệm).
– Bước Dầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế bào).

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn……………………………………………………………………… i
Lời cam Ďoan…………………………………………………………………… ii
Mục lục………………………………………………………………………… iii
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt………………………………………….. viii
Danh mục các bảng………………………………………………………………. xi
Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị………………………………………………….. xii
MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………. 4
1.1. Giới thiệu chung về squalene………………………………….. 4
1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene…………………………………… 4
1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene……………………………. 4
1.1.3 Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật
và vi sinh vật…………………………………………………….. 6
1.1.4 Ứng dụng của squalene…………………………………………. 11
1.1.5. Các nguồn cung cấp squalene…………………………………… 18
1.2. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………..…… 21
1.2.1. Công nghệ tách chiết squalene…………………………………. 21
1.2.2. Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene…………….. 27
1.3. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29
1.4. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium………. 33
1.4.1 Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium…. 33
1.4.2. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
cho sản xuất squalene…………………………………………… 37
1.4.2.1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
cho sản xuất squalene trên thế giới………………………………… 37
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất
squalene ở Việt Nam………………………………………………………….. 39
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 43iv
2.1. Vật liệu…………………………………………………………. 43
2.1.1. Mẫu vật………………………………………………………….. 43
2.1.2. Các bộ kít sinh phẩm……………………………………………. 44
2.1.3. Động vật thí nghiệm…………………………………………….. 45
2.1.4. Các dòng tế bào…………………………………………………. 46
2.1.5. Hoá chất…………………………………………………………. 46
2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm………………………………….. 46
2.1.7. Môi trường nuôi cấy…………………………………………….. 47
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48
2.2.1. Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học;
Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản
xuất squalene cao ………………………………………………………….. 48
2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh
khối khô………………………………………………………………… 48
2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái……………………………………. 49
2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối
tảo……………………………………………………………………….. 49
2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red………………………….. 49
2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA…………………… 49
2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene……………….. 50
2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của
chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất
squalene cao …………………………………………………………… 50
2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch
squalene từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 53
2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng
nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei
PQ6……………………………………………………………………… 53
2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch
squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei
PQ6……………………………………………………………………… 55
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của
squalene.. …………………………………………………………………………. 56v
2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene………………………… 57
2.2.3. Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của
squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………….. 57
2.2.4. Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý
của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực
nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)…………………… 58
2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý
của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in
vivo……………………………………………………………………… 58
2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác
dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6
trên mô hình in vitro………………………………………………….. 59
2.2.5. Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63
2.2.6. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………… 63
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….……………. 65
3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất
squalene………………………………………………………… 65
3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên
sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene………………………….. 67
3.2.1. Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất
squalene ở cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 67
3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene
ở cấp độ bình tam giác……………………………………………….. 67
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm
lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 69
3.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và
hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………… 70
3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm
lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 72
3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và
hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………….…………… 73
3.2.2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên
men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………… 75vi
3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy
squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong
hệ thống bình lên men 30 lít…………………………………………. 75
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene
của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống
lên men 30 lít…………………………………………………………… 77
3.2.2.3 Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh
trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6……… 79
3.2.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy
squalene của chủng S. mangrovei PQ6…………………………. 81
3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S.
mangrovei PQ6…………………………………………………. 86
3.3.1. Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ
S. mangrovei PQ6……………………………………………….. 86
3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6…………. 86
3.3.1.2 Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số……………. 90
3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc
ký lỏng cao áp…………………………………………………………. 91
3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp
dung môi………………………………………………………………… 92
3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô
pilot từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 94
3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ
sinh khối khô S. mangrovei PQ6……………………………………. 95
3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau
quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất ………… 97
3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……… 98
3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene
từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………… 101
3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6… 103
3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim
loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………. 105
3.4. Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từvii
S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in
vivo) và mô hình tế bào (in vitro)……………………………… 107
3.4.1. Độc tính cấp của squalene trên mô hình Ďộng vật thực
nghiệm…………………………………………………………… 107
3.4.2. Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật
thực nghiệm……………………………………………………… 108
3.4.2.1. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể
trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày……………………. 108
3.4.2.2. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và
sinh hóa của chuột…………………………………………………….. 109
3.4.2.3. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi
dùng squalene dài ngày………………………………………………. 112
3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí
nghiệm…………………………………………………………… 114
3.5. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của
squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in
vitro……………………………………………………………… 117
3.5.1. Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào…………… 117
3.5.2. Tác dụng giảm lipit của squalene lên tế bào gan và tế bào Ďại
thụ thể…………………………………………………………… 118
3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm
lượng lipid trong tế bào gan HepG2……………………………….. 118
3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào
trong tế bào gan HepG2 và RAW264.7…………………………….. 119
3.5.3. Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol của squalene tách
chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 121
3.5.4. Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………….. 125
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 127
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ……………………………… 129
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 131
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene…………………………………..… 4
Bảng 1.2 Một số tiêu chuẩn của squalene thương mại…………………………. 17
Bảng 1.3. Tính chất vật lý của một số chất lỏng siêu tới hạn (SCF)……………. 23
Bảng 1.4. Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên…………….. 24
Bảng 1.5. Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên của
Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013),
Beakes và cộng sự, (2014)………………………………………………………. 35
Bảng 2.1. Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium.. 44
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR………….. 45
Bảng 2.3. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu………………… 63
Bảng 3.1. Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng
thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập…………….. 65
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene
trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S.
mangrovei PQ6………………………………………………………… 84
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên
hàm lượng và hiệu suất tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số của
chủng PQ6…………………………………………………………….. 91
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên
hiệu suất tách chiết lipid KXPH và hàm lượng squalene từ lipid tổng
số của chủng PQ6……………………………………………………… 91
Bảng 3.5. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene
tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6…………………………….. 106
Bảng 3.6. Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng…… 107
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng……………… 109
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa
trong máu chuột……………………………………………………….. 109
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột……………. 112
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của squalene lên cân nặng cơ thể và gan chuột nghiên cứu 115
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của squalene lên các chỉ số lipid máu chuột……………… 116xii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó…………………… 5
Hình 1.2. Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A).
Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA tại phần
bào tan và MEP ở lạp thể (B)…………………………………………. 7
Hình 1.3 Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E. coli
(A). Sinh tổng hợp squalene ở nấm men Sacchacromyces cerevisae
(B)………………………………………………………………… 8
Hình 1.4. Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở
Thraustochytrids………………………………………………………. 9
Hình 1.5. Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng
vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6…..………………………………. 41
Hình 2.1. Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei
PQ6……………………………………………………………………. 64
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene
(B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau…………………………………… 68
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm
lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau…………………………. 69
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng (A) và hàm lượng
lipit (B) của S. mangrovei PQ6……………………………………….. 70
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên hàm lượng squalene (A) và hiệu
suất squalene (B) của S. mangrovei PQ6……………………………………….. 71
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng Ďộ terbinafine lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối
khô (B), hàm lượng lipid và squalene (C) của S. mangrovei PQ6…….. 73
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô
(B), hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6…………………. 74
Hình 3.7. Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B)
và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6……………………….. 76
Hình 3.8. Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose
ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400). 77
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khốixiii
khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S.
mangrovei PQ6…………………………………………………………………………… 78
Hình 3.10. Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở
các thời Ďiểm khác nhau khi nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất
trong bình 30 Lít………………………………………………………………………. 80
Hình 3.11. Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S.
mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong nuôi cấy theo mẻ
có bổ sung cơ chất………………………………………………………………………. 81
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm
lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi
cấy theo mẻ S. mangrovei PQ6……………………………………………………. 82
Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên
men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ
sung glucose lên 22%………………………………………………………………….. 85
Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C),
số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G),
nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết
lipid…………………………………………………………………………………………… 87
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ
squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) ………………………………. 92
Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối
S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………….. 92
Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch
sau quá trình làm giàu thông qua quy trình 6 bước (B) ……………………. 93
Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6………………………………………………………………………….. 94
Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh
khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược
tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung môi khác nhau …………….. 95
Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách
chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu
squalene trong mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo cóxiv
Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình
chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có
mặt trong squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ
ẩm 20 và 100%…………………………………………………………………………… 96
Hình 3.21. Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C)
và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10…………………………. 97
Hình 3.22. Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô
(B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei
PQ6…………………………………………………………………………………………… 98
Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene
thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau…………………. 99
Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là nhexan/chloroform (9:1; v/v)…………………………………………………………. 100
Hình 3.25. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là nhexane……………………………………………………………………………………… 100
Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6………………….. 102
Hình 3.27. Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn
hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ
sinh khối tảo chủng PQ6……………………………………………… 103
Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ
sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)……………………………………… 104
Hình 3.29. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6………………………………………………………………. 104
Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh học vi thể – tương ứng (HE, x 400) của
gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng
(a, d, g, k), lô thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m)…. 114
Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene
ở các nồng Ďộ khác nhau……………………………………………… 117xv
Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h
(C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối
loạn chuyển hóa lipid…………………………………………………. 118
Hình 3.33. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích
lũy hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng
Oil Red O (C) trong tế bào HepG2…………………………………… 120
Hình 3.34. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm
lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong
tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………………………….. 120
Hình 3.35. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen
tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2….. 121
Hình 3.36. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và
LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7…………………….. 122
Hình 3.37. Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ
biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào
RAW264.7……………………………………………………………. 124
Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride
trong tế bào HepG2 …………………………………………………………………….. 125
Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm
cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………………..