Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm abo cá thể
Kỹ thuật huyết học xác định được 4 nhóm máu là A, B, O, AB. Sử dụng kĩ thuật PCR và các loại enzym cắt giới hạn có thể xác định kiểu gen của hê kháng nguyên này, cho phép xác định được 6 trạng thái gen là AA, BB, OO, AB, AO, BO. Phương pháp mới sử dụng có đô nhạy rất cao, có thể xác định được các mẫu ADN từ vết máu, nước bọt, tóc nên được áp dụng có hiệu quả trong công tác giám định hình sự.
Những nghiên cứu về các dòng cADN mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO [6] đã xác định được trình tự đoạn gen ABO với kích thước 1000bp. Đổng thời qua những nghiên cứu này, người ta chứng minh được rằng gen mã hoá kháng nguyên A và B có một số gốc bazơ khác nhau ở những vị trí xác định. Điều này dần đến những thay đổi một số’ trình tự axit amin làm cho hoạt tính của A và B-transferase khác nhau. Sự khác nhau đó đã được các tác giả tìm ra tại nucleotit 700 của gen B. Tại vị trí này, bazơ G được thay thế’ bằng bazơ A có ở thể dại. Vị trí đột biến này tạo ra điểm nhận biết của enzym giới hạn Alul. Đổng thời, nghiên cứu trên gen O chứng minh sự vắng mạt của bazơ G ở vị trí 258, do đó gen mã hoá tổng hợp protein không có hoạt tính transferase. Đột biến này tạo thêm một vị trí nhận biết nữa đối với gen O bởi enzym giới hạn Kpnl.
Tiếp theo những nghiên cứu trên, Carll Ladd và cộng sự 1996 [2] đã đưa ra một phương pháp nhằm xác định kiểu gen nhóm máu ABO. Sử dụng đôi mổi thứ nhất (DHF1 và DHR2) bằng kỹ thuật PCR, nhóm tác giả đã nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thước 209/210bp. Sản phẩm này sẽ mang vị trí đột biến tại bazơ 258 nếu allen O có mạt. Đôi mổi tiếp theo (DHF3 và DHR3) sẽ nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thước 175bp. Sản phẩm này mang vị trí đột biến tại bazơ 700 nếu allen B có mạt. Sau đó, các tác giả sử dụng kỹ thuật cắt sản phẩm PCR bằng hai loại enzym Kpnl và Alul. Đối với sản phẩm 210/209pb, nếu allen O có mạt, Kpnl sẽ cắt thành các đoạn 177bp và 32bp. Còn sản phẩm 175bp nếu có mạt allen B, Alul sẽ cắt sản phẩm thành các đoạn 94bp và 81bp. Cuối cùng, dựa vào sự thể hiên của các băng ADN trên điên di đổ (gel agarose), người ta có thể phân tích tính đa hình của đoạn gen ABO thể hiên ở 6 kiểu gen khác nhau là: AA, BB, OO, AO, BO, AB.
Những nghiên cứu trên đã tạo cơ sở để khắc phục một loạt khó khăn gạp phải khi xác định nhóm ABO bằng kỹ thuật huyết thanh học, đổng thời với các kỹ thuật hiên đại, có độ nhạy và tính đạc hiêu cao của sinh học phân tử, viêc xác định nhóm máu ABO không chỉ dừng lại ở mức độ xác định kiểu hình với 4 nhóm như trước kia mà thay vào đó có thể xác định được 6 kiểu gen khác nhau, do đó tăng khả năng phân biệt hê thống nhóm ABO.
Với những cơ sở lý thuyết và nghiên cứu thực tế đã nêu, chúng tôi đạt vấn đề nghiên cứu xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể bằng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phẫn bổ sung một phương pháp mới có đô nhạy rất cao phục vụ việc giám định truy nguyên nhóm dùng cho công tác giám định hình sự.
Mục tiêu nghiên cứu:
– Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thực hiện phản ứng nhân bội gen mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO.
– Nghiên cứu lựa chọn những phương pháp thích hợp để tách chiết ADN từ các mầu sinh học (máu, lông, nước bọt… ) cho phản ứng PCR.
– Phân tích tính đa hình của đoạn gen mã hoá tổng hợp kháng nguyên nhóm máu ABO, nghiên cứu xây dựng một quy trình ổn định để xác định dấu vết thu được trong điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu
1. Đối tượng:
– Máu tươi, máu trên giấy thấm Walkman, nước bọt trên giấy thấm Walkman, nước bọt thấm vào bông, chân tóc.
– Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN; hoá chất dùng cho PCR; hoá chất dùng cho enzym cắt giới hạn Kpnl và Alul; hoá chất dùng cho điện di và nhuộm gel của các hãng Sigma và Biorad.
2. Phương pháp:
a. Tách ADN:
Đã có rất nhiều phương pháp được nêu ra để tách chiết ADN từ các tài liệu đã được công bố’ trên thế giới và trong nước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết ADN của Banaschak S. và cộng sự [1].
b. Kỹ thuật PCR:
Quá trình PCR được tiến hành trong ống nghiệm eppendorf 0,5 ml. Thành phẫn phản ứng gồm: 0,2mM dNTPs; 10mM tris HCl, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2; 2 đơn vị Taq polymeraza; 15 pmol mỗi mồi, nước cất khử ion; dẫu khoáng.
Phản ứng được thực hiện trên máy PCR tiến hành với 950C: 5 phút; 45 chu kỳ ở các nhiệt độ: 94oC – 1 phút; 58oC – 1 phút; 72oC – 2 phút.
c. Sử dụng enzym giới hạn để phân tích đoạn gen mã hoá kháng nguyên ABO:
Trên đoạn gen mã hoá tổng hợp kháng nguyên ABO, người ta tìm thấy có 2 vị trí có thể sử dụng enzym cắt giới hạn để phân tích điểm đột biến: Vị trí bazơ 258 ở người có gen mã hoá kháng nguyên O có thể dùng enzym giới hạn Kpn I để cắt. Sản phẩm cắt sẽ cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau. Tương tự, tại vị trí bazơ 700 của gen mã hoá kháng nguyên B người ta sử dụng enzym Alu I cắt. Kết quả cắt cũng cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau.
Kỹ thuật cắt bằng hai loại enzym giới hạn Kpn I và Alu I được chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Carll và cộng sự, 1996 [2].
d. Kỹ thuật điện di:
Các sản phẩm PCR được kiểm tra, phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agaroza 2,5% trong đệm TBE, nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh trên đèn cực tím
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích