Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam
Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam.Gan và thận đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa và bài tiết của cơ thể. Do là cửa ngõ tiếp xúc đồng thời là nơi chuyển hóa, bài tiết các chất nên gan và thận cũng là hai cơ quan chịu sự ảnh hưởng của nhiều tác nhân gây tổn thương. Các bệnh về gan và thận chiếm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong lớn trên thế giới. Theo báo cáo về gánh nặng bệnh tật thế giới năm 2019, bệnh gan chiếm khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm [32]. Trong khi đó, theo báo cáo năm 2018 của Hiệp hội thận quốc tế (International Society of Nephrology, ISN) và Tổ chức cấy ghép, lọc thận – Hiệp hội thận Châu Âu (European Renal Association – European Dialysis and Transplant Association, ERA – EDTA), ước tính khoảng 850 triệu người trên toàn thế giới mắc các bệnh về thận [323], con số này gần gấp đôi số người mắc bệnh đái tháo đường (422 triệu, [234]) và gấp 20 lần số người nhiễm HIV/AIDS (37,9 triệu [327]). Stress oxy hóa đã được chứng minh là một trong các cơ chế chính dẫn đến tổn thương gan, thận cấp và mạn tính [20], [131], [205].
Nhiều hợp chất polyphenol từ dược liệu với tiềm năng chống oxy hóa tốt đã chứng minh tác động bảo vệ gan như silymarin từ cây Kế sữa (Silybum marianum L.) [290], curcumin từ Nghệ (Curcuma longa) [102], andrographolid và neoandrographolid từ Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees), phyllanthin và glycyrrhizin từ Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri L.) [185]; bảo vệ thận như ginsenoside Rb3 từ lá Sâm (Panax quonthefolius) [306]; ginsenoside Rh4 và Rk3 từ Nhân sâm (Panax ginseng) [34], hesperidin trong trái cây họ Cam quýt [240]; isoliquiritigenin từ loàiGlycyrrhiza [151]…
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ước tính khoảng 60 – 90% dân số các nước đang phát triển sử dụng y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu [300]. Xu hướng sử dụng y học cổ truyền trong hỗ trợ và điều trị bệnh thúc đẩy các nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu trên các loại dược liệu và hợp chất chiết xuất thiên nhiên với các hoạt tính sinh học tiềm năng khác nhau.
Với khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, có bề dày kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc để chữa bệnh, đây là kho tàng giúp phát triển nghiên cứu tạo ra các sản phẩm từ thiên nhiên phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe và phát triển kinh tế. Một trong những loài dược liệu quý ở ViệtNam đã được biết đến là Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.), một loài thuộc nhóm cây “Tổ kiến” (ant-plants), họ Cà phê (Rubiaceae). Một vài loài cây Tổ kiến có giá trị chữa bệnh như H. formicarum Jack., Myrmecodia pendens, M. tuberosa Jack. [123], [165]. Bí kỳ nam (H. formicarum ) thuộc chi Hydnophytum thường phân bố các nước châu Á như Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam. Một số nghiên cứu bước đầu cho thấy loài cây này có các thành phần polyphenol, có tác dụng chống oxy hóa in vitro [223], kháng khuẩn [222], ức chế α-glucosidase [84], ức chế sự tăng trưởng của tế bào u xơ HT1080 [285], tế bào ung thư cổ tử cung Hela [248] và bảo vệ tế bào thần kinh [97]. Tại Việt Nam, Bí kỳ nam được tìm thấy ở Vườn quốc gia Phú Quốc, một trong những trung tâm đa dạng sinh học của cả nước. Đây là nơi có hệ động thực vật phong phú và chứa nhiều nguồn gen quý hiếm cần lưu trữ, phát triển và bảo tồn [10]. Từ xa xưa, dân gian Việt Nam đã dùng Bí kỳ nam chữa viêm gan, vàng da, đau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp, đau bụng, tiêu chảy… bằng cách sắc hoặc nấu cao uống [5]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về tác động dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu này. Với mong muốn nghiên cứu một cách khoa học công dụng dân gian, các tác dụng dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu từ đó góp phần tạo cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, sản xuất sản phẩm thiên nhiên có chất lượng và gia tăng giá trị sử dụng của Bí kỳ nam, “Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)” được thực hiện với các nội dung cụ thể:
1. Phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang.
2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần Bí kỳ nam. Lựa chọn và khảo sát chất lượngcao chiết. Chiết xuất các cao phân đoạn từ cao toàn phần và phân lập chất.
3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam.
4. Khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống của cao Bí kỳ nam
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………………………………….. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………………………………………….. ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………………………………………. iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………………………………………… iv
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ …………………………………………………………………………….. v
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………………………. 1
1.1. BÍ KỲ NAM……………………………………………………………………………………………. 1
1.2. STRESS OXY HÓA ………………………………………………………………………………. 10
1.3. GAN VÀ TRESS OXY HÓA ………………………………………………………………….. 20
1.4. THẬN VÀ STRESS OXY HÓA ……………………………………………………………… 23
1.5. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN …………………….. 26
1.6. CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN …………………… 35
1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ …………………………………………………………. 41
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………….. 45
2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………… 45
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU …………………………………………………………………. 46
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU …………………………………………….. 46
2.4. DUNG MÔI , HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ ………………….. 47
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………………………………………….. 50
2.6. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ ……………………….. 69
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ……………………………………………………………………………… 70
3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM ……………………………………………………………. 70
3.2. CHIẾT XUẤ T VÀ SÀNG LỌC CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM ………. 76
3.3. CHIẾT XUẤT VÀ KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CAO CỒN 50% ……………….. 80
3.4. CÁC CAO PHÂN ĐOẠN VÀ HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN ……………….. 82
3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% ………………………….. 84
3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN CỦA BÍ KỲ NAM ………………………………………… 85
3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM ………………………………………. 98
3.8. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐƯỜNG UỐNG CỦA CAO CỒN 50% BÍ
KỲ NAM ……………………………………………………………………………………………. 111
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ………………………………………………………………………….. 117
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………… 14
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các nguyên tố vô cơ có trong Bí kỳ nam ……………………………………………. 4
Bảng 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Bí kỳ nam ……………………………………………….. 7
Bảng 1.3 Một số mô hình in vitro gây tổn thương gan bởi CCl4 tế bào HepG2 ……. 28
Bảng 1.4 So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan ……………………………. 29
Bảng 1.5 Một số mô hình in vivo gây tổn thương gan bởi CCl4 …………………………. 32
Bảng 1.6 Một số nghiên cứu trên mô hình in vitro gây độc tế bào thận ………………. 36
Bảng 1.7 Một số nghiên cứu trên mô hình in vivo gây độc thận ………………………… 40
Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu ……………….. 47
Bảng 2.2 Danh mục thiết bị đã sử dụng trong nghiên cứu …………………………………. 49
Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR ………………………….. 73
Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dược liệu Bí kỳ nam ……….. 74
Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dược liệu Bí kỳ nam …………………………………………. 75
Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol toàn phần của dược liệu Bí kỳ nam ………………… 76
Bảng 3.5 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (DPPH) …………….. 77
Bảng 3.6 Phương trình tuyến tính, IC50 của các cao Bí kỳ nam (MDA) ……………… 77
Bảng 3.7 Hoạt tính của cao Bí kỳ nam đối với sự tăng trưởng các dòng tế bào ……. 78
Bảng 3.8 Giá trị hồi quy đa thức và IC50 các cao toàn phần Bí kỳ nam ……………….. 80
Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam …………………….. 81
Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH) ……………………… 82
Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)………………………. 82
Bảng 3.12 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào gan HepG2 ……. 85
Bảng 3.13 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào gan HepG2
do CCl4 gây ra ……………………………………………………………………………………….. 85
Bảng 3.14 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa tình trạng hoại tử tế bào gan HepG2
do CCl4 gây ra ……………………………………………………………………………………….. 89
Bảng 3.15 Trọng lượng chuột trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam .. 91
Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong khảo sát tác động bảo vệ gan của Bí kỳ nam ….. 93
Bảng 3.17 Kết quả vi thể gan chuột trong thử nghiệm bảo vệ gan của Bí kỳ nam … 96
iii
Bảng 3.18 Tác động của cisplatin ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau lên tế
bào HEK 293 nuôi cấy ở các mật độ khác nhau …………………………………………. 98
Bảng 3.19 Tác động của cisplatin 25 µM sau 24 giờ xử lý lên tế bào HEK 293…. 100
Bảng 3.20 Tác động của Bí kỳ nam lên sự tăng trưởng của tế bào HEK 293 …….. 101
Bảng 3.21 Tác động phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào thận HEK 293 do
cisplatin gây ra …………………………………………………………………………………….. 102
Bảng 3.22 Tác động của Bí kỳ nam phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293 do
cisplatin gây ra …………………………………………………………………………………….. 104
Bảng 3.23 Trọng lượng cơ thể chuột trong tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam .. 106
Bảng 3.24 Nồng độ ure và creatinin máu trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí
kỳ nam ……………………………………………………………………………………………….. 107
Bảng 3.25 Hàm lượng GSH thận trong khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo …… 110
Bảng 3.26 Vi thể thận chuột trong khảo sát tác động bảo vệ thận của Bí kỳ nam . 111
Bảng 3.27 Trọng lượng chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ………… 112
Bảng 3.28 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số hồng cầu trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ……………………………………………………………. 113
Bảng 3.29 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số bạch cầu trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ……………………………………………………………. 114
Bảng 3.30 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số tiểu cầu trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn ……………………………………………………………. 114
Bảng 3.31 Tác động của cao cồn 50% Bí kỳ nam lên các chỉ số chức năng gan và thận
trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn ……………………………………………… 1