Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng, (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến.Ung thư và bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, trong đó ung thư đang dần có xu hướng vượt bệnh tim mạch trở thành nguyên nhân hàng đầu gây tử vong sớm ở hầu hết các quốc gia [1]. Theo thống kê của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, năm 2020 ước tính thế giới có 19,3 triệu ca ung thư mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư [2]. Tại Việt Nam, trong năm 2020 ước tính số ca ung thư mới là 182563 (0,19 % dân số) và số người chết ước tính là 122690 (0,13% dân số) [3]. Gánh nặng ung thư ở Việt Nam đã tăng gấp ba lần trong 30 năm qua [4]. Do tính chất ác tính của bệnh, những tác dụng phụ của hóa trị liệu và xạ trị, giá thành cao của các thuốc điều trị ung thư, việc điều trị ung thư là một gánh nặng lớn cho bệnh nhân, gia đình và xã hội.

Tam thất (Panax notoginseng) từ lâu được biết đến là một dược liệu quý với công năng chủ yếu là tán ứ, hoạt huyết, chỉ huyết [5]. Tam thất còn có tên kim bất hoán, nhân sâm tam thất, sâm tam thất. Tên kim bất hoán (vàng không đổi), ý nói là vị thuốc Tam thất rất quý, vàng cũng không thể đổi được [6]. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã chứng minh Tam thất có nhiều tác dụng quý trong điều trị ung thư, rối loạn tim mạch, huyết ứ, giảm viêm, phù nề và giảm đau…[7]. Tác dụng chống ung thư của các hoạt chất trong Tam thất gần đây được quan tâm nghiên cứu, cho thấy tiềm năng tốt trong điều trị ung thư [8], [9]. Đặc biệt, một số tác giả báo cáo việc hấp hơi rễ Tam thất làm tăng hoạt tính chống ung thư [10], [11], [12].
Ở Việt Nam, cây Tam thất đã được di thực từ những năm 1964 từ Trung Quốc. Cây được nhập trồng ở tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai nhưng chưa được quan tâm phát triển nên dược liệu Tam thất ở nước ta vẫn chủ yếu nhập từ Trung Quốc. Là một trong những cây thuốc quan trọng của vùng Tây Bắc, Tam thất gần đây đang được quan tâm và khôi phục lại việc trồng trọt và phát triển ở một số vùng dược liệu trong nước, đặc biệt là ở huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai. Việc nghiên cứu tác dụng định hướng điều trị ung thư của dược liệu quý này góp phần nâng cao giá2 trị và tạo đầu ra cho dược liệu Tam thất trồng tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Hơn nữa, thực tế về gánh nặng điều trị bệnh ung thư hiện nay rất cần những sản phẩm từ dược liệu có hiệu quả tốt trong điều trị ung thư, ít tác dụng phụ, giá thành phù hợp. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về các thông số trong quá trình hấp hơi nóng tác động đến hàm lượng các saponin và các hoạt tính định hướng điều trị ung thư của Tam thất trồng tại Việt Nam.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất (Panax notoginseng, (Burk.) F.H. Chen, Araliaceae) trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến”, với mục tiêu:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất.
2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.
3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng sau hấp nhiệt

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………………. 1
CHƯƠNG 1 …………………………………………………………………………………………….. 3
TỔNG QUAN ………………………………………………………………………………………….. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ………………………………………………….. 3
1.1.1. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam ……………………………………. 3
1.1.2. Ung thư với đáp ứng miễn dịch ……………………………………………………….. 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT………………………………………………………… 11
1.2.1. Tổng quan thực vật……………………………………………………………………….. 11
1.2.2. Hóa thực vật rễ củ Tam thất………………………………………………………….. 14
1.2.3. Các tác dụng dược lý của Tam thất………………………………………………… 16
1.2.3.1. Tác dụng chống ung thư ……………………………………………………………… 16
1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch…………………………………………………….. 18
1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan ………………………………… 19
1.2.3.4. Các tác dụng khác ………………………………………………………………………. 21
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC
DỤNG KHÁNG U …………………………………………………………………………………. 22
1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro …………………………………………………….. 22
1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo……………………………………………………… 26
CHƯƠNG 2 ………………………………………………………………………………………….. 31
CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………… 31
2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………. 31
2.1.1. Chất liệu nghiên cứu……………………………………………………………………… 312.1.2.Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………………………….. 35
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu ………………………. 35
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu………………………………………. 35
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu…………………………………………………. 37
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………… 39
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến bằng hấp nhiệt đến
hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất……………………………………………………. 39
2.2.1.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có trongcác
mẫu Tam thất hấp và không hấp. …………………………………………………………….. 39
2.2.1.2. Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất trước và sau khi
hấp ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
…………………………………………………………………………………………………………….. 40
2.2.1.3. Định lượng hàm lượng saponin trong 2 mẫu cao NP(O) và NP(H) bằng HPLC
…………………………………………………………………………………………………………….. 42
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng
và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ………………………………………… 42
2.2.2.1. Đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng
NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người………………………………… 42
2.2.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào
theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung
thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. ……………………………………………………… 44
2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u của các cao định lượng NP(H)
và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180………………. 48
2.2.2.4. Đánh giá tác dụng của các cao định lượng NP(H) và NP(O) lên hệ miễn
dịch của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180……………………………………….. 502.2.2.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các cao định lượng NP(H) và
NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG180. ………………………………….. 52
2.2.2.6. Xác định thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.53
2.2.3. Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng
NP(H)………………………………………………………………………………54
2.2.3.1. Đánh giá độc tính cấp của cao định lượng NP(H) trên chuột nhắt trắng
…………………………………………………………………………………………………………….. 54
2.2.3.2. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) trên chuột
cống trắng……………………………………………………………………………………………… 55
2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU …………………………………………………………………………….. 56
2.4. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU………………………………………….. 56
CHƯƠNG 3 …………………………………………………………………………………………… 59
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………….. 59
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến hàm lượng
saponin của rễ củ Tam thất ……………………………………………………………………. 59
3.1.1. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các saponin chính có
trong các mẫu Tam thất hấp và không hấp ……………………………………………… 59
3.1.1.1. Phân lập các saponin từ rễ củ Tam thất (dược liệu không xử lý hấp)… 59
3.1.1.2. Phân lập các saponin rễ Tam thất sau khi hấp ở nhiệt độ cao ………….. 61
3.1.1.3. Đặc trưng vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất phân lập được…………….. 64
3.1.1.4. Biện giải cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ củ Tam thất……………… 72
3.1.2. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng hoạt chất trong Tam thất khi hấp
ở các điều kiện khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
………………………………………………………………………………78
3.1.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký ……………………………………………………………. 78
3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn ……………………………………………………………….. 793.1.2.3. Kết quả định lượng các saponin chính từ Tam thất hấp ở các điều kiện khác
nhau……………………………………………………………………………………………………… 82
3.1.3. Hiệu suất chiết cao và kết quả định lượnghàm lượng saponin trong 2
mẫu cao định lượng NP(O) và NP(H) bằng HPLC. ………………………………….. 86
3.1.3.1. Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu ………………………………………. 86
3.1.3.2. Định lượng các mẫu cao chiết………………………………………………………. 87
3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định
lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất……………………………………. 88
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao
định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người…………….. 88
3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế
bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào
ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180………………………………………………. 91
3.2.2.1. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H). 91
3.2.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình
(apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết
chuột sarcoma TG180. ……………………………………………………………………………. 94
3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và
NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180………………… 97
3.2.3.1. Kết quả tạo mô hình khối u sarcoma TG 180 trên chuột ………………….. 97
3.2.3.2. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến trọng lượng cơ thể
của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180……………………………………………… 98
3.2.3.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đến sự phát triển khối
u rắn sarcoma TG 180…………………………………………………………………………….. 99
3.2.4. Kết quả đánh giá tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn
dịch trên chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ………………………………….. 1033.2.4.1. Kết quả đánh giá số lượng và công thức bạch cầu trong máu chuột.. 103
3.2.4.2. Kết quả đánh giá nồng độ IL-2 và TNF-α máu……………………………… 104
3.2.4.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu huyết học…………………………………… 105
3.2.4.4. Kết quả đánh giá cân nặng của lách và tuyến ức ………………………….. 107
3.2.5. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa củacao định lượngNP(H) và
NP(O)trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. ………………………………. 108
3.2.5.1. Hàm lượng MDA, GSH, SOD và CAT trong gan chuột mang khối u rắn
sarcoma TG180. …………………………………………………………………………………… 108
3.2.5.2. Hoạt độ các enzym ALT, AST trong máu chuột mang khối u rắn
sarcoma TG180. …………………………………………………………………………………… 110
3.2.5.3. Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) và NP(O) đối với hình thái đại
thể và vi thể của gan chuột trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180……. 111
3.3.6. Kết quả đánh giá tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của cao định
lượng NP(H) và NP(O) trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180………. 113
3.4. Kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H)……………………….. 116
3.4.1. Kết quả xác định độc tính cấp (LD50) của NP(H) ………………………….. 116
3.4.2. Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của NP(H)…………………… 117
CHƯƠNG 4 …………………………………………………………………………………………. 126
BÀN LUẬN …………………………………………………………………………………………. 126
4.1. Về ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng các
saponin của rễ củ Tam thất ………………………………………………………………….. 128
4.1.1. Hàm lượng saponin của Tam thất chưa hấp………………………………….. 128
4.1.2. Hàm lượng saponin của Tam thất sau hấp ……………………………………. 129
4.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ
Tam thất ……………………………………………………………………………………………… 1304.2. Về tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số
saponin phân lập từ rễ củ Tam thất. ……………………………………………………… 132
4.2.1. Về tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng
NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người…………………………….. 132
4.2.2. Về kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình
(apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết
chuột sarcoma TG180. …………………………………………………………………………. 134
4.2.3. Về kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H)
và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180………….. 136
4.2.3.1. Về mô hình nghiên cứu ……………………………………………………………… 136
4.2.3.2. Về liều dùng của cao định lượng NP(H) và NP(O)………………………… 138
4.2.4. Về tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn dịch trên
chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 ………………………………………………… 141
4.2.5. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u rắn
sarcoma TG 180…………………………………………………………………………………… 145
4.2.6. Về tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn
sarcoma TG 180…………………………………………………………………………………… 147
4.3. Về kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H). ………………….. 153
4.3.1. Về độc tính cấp của cao định lượng NP(H). …………………………………… 153
4.3.2. Về độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H). ………………… 154
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………….. 159
KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………………………………. 161
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC