Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm

Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm.Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Những năm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng các hạt nano, …. Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa hẹn, nhưng kết quả vẫn chỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC đã di căn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%.

Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ chế bệnh ung thư và virus. Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả năng lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư. Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. OV có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng. Hiện nay, với sự phát triển về sinh học đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơ thể.
Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh2 có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1.1).
Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mô toàn cầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công, thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới. Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạch đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ.
Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và MuV điều trị ung thư đại tràng người. Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với mục tiêu sau:
1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro.
2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29

MỤC LỤC Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………….. 3
1.1. Giới thiệu chung…………………………………………………………………………. 3
1.2. Ung thư đại trực tràng…………………………………………………………………. 5
1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng……………………………………………… 5
1.2.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng………………………………………… 6
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng ……………………………. 7
1.3. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng
người …………………………………………………………………………………………….. 22
1.3.1. Sinh học virus sởi và quai bị …………………………………………………. 22
1.3.2. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư
đại trực tràng……………………………………………………………………………….. 24
1.3.3. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư
đại trực tràng……………………………………………………………………………….. 27
1.4. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm
sàng……………………………………………………………………………………………….. 35
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….. 38
2.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………………….. 38
2.1.1. Động vật …………………………………………………………………………….. 38
2.1.2. Chất liệu nghiên cứu ……………………………………………………………. 382.1.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu …………………………………… 38
2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………………. 40
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào ……………….. 40
2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị
từ nguồn virus vaccine ………………………………………………………………….. 42
2.2.3. Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi và quai bị ly giải tế bào
bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium
bromide……………………………………………………………………………………….. 45
2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị
đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng
phương pháp dòng chảy ………………………………………………………………… 48
2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo
chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng
chảy…………………………………………………………………………………………….. 51
2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude)……….. 54
2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-
29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u………….. 55
2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và
quai bị…………………………………………………………………………………………. 56
2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi và
quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29..56
2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn
dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và
quai bị…………………………………………………………………………………………. 57
2.2.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt miễn
dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai bị
bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy………………………………… 59
2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị
bằng virus vaccine sởi và quai bị……………………………………………………. 61
2.2.13. Phương pháp phân tích kết quả …………………………………………… 62SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU……………………………………………………………………….. 64
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………. 65
3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị ………. 65
3.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero………………………………… 65
3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ….. 66
3.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50 …….. 67
3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại
tràng người HT-29 in vitro……………………………………………………………….. 68
3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in
vitro…………………………………………………………………………………………….. 68
3.3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng người
HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5-
Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide…………………… 69
3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo
chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro.73
3.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng
người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch…………………………. 90
3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 …….. 90
3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng
người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị………………………………… 91
3.4.3. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở các
nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị…………. 96
3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều
trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ……………………………………………….. 99
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………………………. 101
4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người
HT-29 in vitro ………………………………………………………………………………. 101
4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero ………………………………………………… 101
4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29.. 102
4.2. Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50 ……………. 1034.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người
HT-29 in vitro ………………………………………………………………………………. 107
4.3.1. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại
tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro…………………………. 107
4.3.2. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi và
quai bị bằng nghiệm pháp 3 – (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) – 2,5 diphenyl
tetrazolium bromide ……………………………………………………………………. 109
4.3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích
hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro ……………………. 112
4.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người
HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch………………………………………………. 123
4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu
hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ……. 123
4.4.2. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng
người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch…………………………………… 125
4.4.3. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng
u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch.128
4.4.4. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên
chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và
quai bị……………………………………………………………………………………….. 134
KẾT LUẬN……………………………………………………………………………………… 140
1. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp và kích
hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung thư đại
tràng người HT-29 ………………………………………………………………………… 140
2. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng tế bào
ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude……………………139
KHUYẾN NGHỊ………………………………………………………………………………. 142
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN …………………………………………………………………. 143
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………….. 144

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN
1. Le Duy Cuong, Nguyen Linh Toan, Ho Anh Son, et al. (2016). Investigation the ability to stimulate immune response by using complex oncolytic virus measle/mump in nude mouse model bearing human colon cancer. Journal of Military Pharmaco-medicine, 7:17-21.
2. Lê Duy Cương, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn. (2018). Đánh giá hiệu quả ly giải tế bào u đại trực tràng của vắc xin virut sởi và quai bị dùng phối hợp in vitro. Tạp chí Y Dược học Quân sự, 2:24-31.
3. Lê Duy Cương, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn và cs. (2018). Tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đạii trực tràng người. Tạp chí Y Dược học Quân sự, 3:38-44.
4. Ho Anh Son, LiFeng Zhang, Bui Khac Cuong, Hoang Van Tong, Le Duy Cuong, Ngo Thu Hang, Hoang Thi My Nhung, Naoki Yamamoto & Nguyen Linh Toan. (2018). Combination of vaccine-strain measles and mumps viruses enhances Oncolytic Activity against Human Solid Malignancies. Cancer investigation, 36(2):106–11