Nghiên cứu tác dụng liền vết thương in vitro sử dụng exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ kết hợp plasma lạnh

Luận án tiến sĩ y học Nghiên cứu tác dụng liền vết thương in vitro sử dụng exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ kết hợp plasma lạnh. Da là cấu trúc bao phủ cơ thể con người có chức năng quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng giữa môi trường bên trong và bên ngoài của cơ thể. Trong trường hợp tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của da bị tổn thương, một loạt các cơ chế sinh lý và bệnh lý liên quan đến chữa lành vết thương sẽ được khởi động nhằm mục đích bảo vệ cơ thể. Cơ chế liền vết thương là một quá trình phức tạp với sự tham gia của nhiều loại các tế bào khác nhau thông qua các con đường tín hiệu tương tác trong chất nền ngoại bào.1 Quá trình liền vết thương đặc trưng với một số giai đoạn chính chồng chéo nhau như cầm máu, viêm, tăng sinh, di cư, sửa chữa và tái cấu trúc mô.

Quá trình này có thể bị rối loạn gây ra các biểu hiện như tăng mô sẹo, tăng sắc tố, thời gian liền vết thương kéo dài trên 4 tuần, và nếu không được điều trị hoặc can thiệp đúng cách, có thể gây nên các biến chứng như hoại tử mô, loét mạn tính, nhiễm trùng huyết hoặc cắt cụt chi. 2,3 Nhiều phương pháp hỗ trợ điều trị liền vết thương đã được nghiên cứu nhằm hỗ trợ điều trị cho các vết thương chậm liền bên cạnh các phương pháp truyền thống như sử dụngkháng sinh và chăm sóc vết thương tại chỗ. Các ứng dụng gần đây có thể đề cập đến như phương pháp plasma, laser, băng vết thương sinh học, kích thích điện, oxy hyperbaric, ghép da nhân tạo hay sử dụng các sản phẩm tế bào và từ môi trường nuôi cấy tế bào.3 Trong đó, hai phương pháp đang nhận được nhiều chú ý trong hỗ trợ điều trị liền vết thương là công nghệ plasma lạnh áp suất khí quyển và sử dụng thể tiết ngoại bào exosome, đặc biệt là các thể tiết từ tế bào gốc trung mô phân lập từ mô mỡ.
Mặc dù các plasma nhiệt từ lâu đã được sử dụng trong các lĩnh vực y tế khác nhau (Ví dụ như việc khử trùng dụng cụ y tế), tuy nhiên các nghiên cứu thực nghiệm gần đây cho thấy rằng tia plasma lạnh ở điều kiện áp suất khí quyển cho phép khử trùng hiệu quả các mầm bệnh khác nhau như vi khuẩn2 gram dương và vi khuẩn gram âm, nấm, virus, bào tử và ký sinh trùng đồng thời loại bỏ mô tổn thương một cách chính xác từ đó tạo điều kiện kích thích chữa lành vết thương.4 Các nghiên cứu in vitro chứng minh rằng phương pháp điều trị bằng plasma ảnh hưởng có lợi đến việc chữa lành vết thương không chỉ bằng cách giảm sự xâm nhập của vi khuẩn mà còn tăng cường sự phát triển các tế bào biểu bì.5,6 Trong khi đó, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các tế bào gốc trung mô mô mỡ có thể tiết ra các thể tiết ngoại bào exosome, thúc đẩy tái biểu mô hóa vết thương ở da thông qua việc tăng sinh tế bào biểu mô và kích thích hình thành mạch, hoạt hóa bài tiết collagen và elastin của nguyên bào sợi và ngăn ngừa sự hình thành nguyên bào sợi quá mức do đó làm giảm sự hình thành sẹo ở vùng tổn thương.7,8
Trong những năm trở lại đây, công nghệ plasma lạnh cũng như exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ đã được áp dụng riêng rẽ trên các mô hình liền vết thương in vitro, in vivo và một số ca bệnh trên lâm sàng, đặc biệt là những trường hợp có tổn thương da mạn tính.5,6,7,8 Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu tác dụng cộng gộp trong cơ chế liền vết thương của cả hai phương pháp này trên cùng một mô hình. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng liền vết thương in vitro sử dụng exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ kết hợp plasma lạnh” với các mục tiêu sau:
1. Phân lập, tách chiết và xác định đặc tính của exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ
2. Đánh giá hiệu quả liền vết thương in vitro sử dụng exosome từ tế bào gốc trung mô mô mỡ và plasma lạnh.
3. Kiểm tra kết quả in vitro trên vết thương da động vật thực nghiệm

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN………………………………………………………………… 3
1.1. Tổng quan về vết thương da…………………………………………………………. 3
1.1.1. Các vết thương da và quá trình liền vết thương da……………………. 3
1.1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình liền vết thương ……………. 8
1.2. Tổng quan về exosome từ tế bào gốc trung mô và plasma lạnh………. 11
1.2.1. Tế bào gốc trung mô…………………………………………………………… 11
1.2.2. Tổng quan về các thể tiết ngoại bào exosome………………………… 14
1.2.3. Tổng quan về plasma lạnh …………………………………………………… 19
1.3. Nghiên cứu về tác dụng của exosome từ MSC mô mỡ và CAP trên
mô hình vết thương in vitro ……………………………………………………………… 26
1.3.1. Khả năng hỗ trợ liền vết thương in vitro khi chiếu CAP………….. 26
1.3.2. Khả năng hỗ trợ liền vết thương in vitro khi sử dụng MSC-EX ….. 29
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 31
2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu………………………………………………… 31
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu và tiêu chuẩn lựa chọn: ………………………….. 31
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu:………………………………………………………… 31
2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………… 31
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………………………….. 31
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 1: phân lập, tách chiết và
xác định đặc tính của exosomes từ tế bào gốc trung mô mô mỡ…. 32
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 2: Xây dựng và đánh giá
hiệu quả của ADMSC-EX và CAP trên mô hình liền vết thương
in vitro………………………………………………………………………………… 40
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 3: Kiểm tra kết quả in
vitro trên vết thương da động vật thực nghiệm…………………………. 432.3. Biến số và chỉ số nghiên cứu ……………………………………………………… 50
2.3.1. Biến số và chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 1: ………………………… 50
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 2: ………………………… 51
2.3.3. Biến số và chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 3: ………………………… 51
2.4. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ………………………………………………….. 51
2.5. Phương pháp phân tích số liệu……………………………………………………. 52
2.6. Đạo đức nghiên cứu ………………………………………………………………….. 52
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………. 53
3.1. Phân lập, tách chiết và xác định đặc tính của exosomes từ tế bào gốc
trung mô mô mỡ……………………………………………………………………………… 53
3.1.1. Phân lập và xác định đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .. 53
3.1.2. Phân lập, tách chiết và xác định đặc tính của exosome từ tế bào
gốc trung mô mô mỡ…………………………………………………………….. 60
3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả liền vết thương in vitro sử dụng exosome
từ tế bào gốc trung mô mô mỡ và plasma lạnh……………………………………. 67
3.2.1.Kết quả tối ưu phương pháp chiếu plasma lạnh trên nguyên bào sợi… 67
3.2.2.Kết quả kích thích di chuyển nguyên bào sợi trên mô hình liền
vết thương in vitro trên đĩa 24 giếng sử dụng exosome từ MSC
mô mỡ và plasma lạnh …………………………………………………………. 70
3.2.3.Kết quả kích thích tăng sinh nguyên bào sợi trên đĩa 96 giếng sử
dụng exosome từ MSC mô mỡ và plasma lạnh………………………… 72
3.3. Kiểm tra kết quả in vitro trên vết thương da động vật thực nghiệm … 73
3.3.1.Kết quả xây dựng mô hình ĐTĐ kèm rối loạn lipid trên chuột
cống trắng……………………………………………………………………………. 73
3.3.2. Kết quả điều trị vết thương trên chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP sử
dụng exosome từ MSC mô mỡ và plasma lạnh………………………… 77
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN………………………………………………………………….. 904.1. Về kết quả phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tách chiết
exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ…………… 90
4.1.1.Về kết quả phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ………………… 90
4.1.2.Về kết quả cô lập và xác định đặc điểm của exosome từ môi
trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô mô mỡ……………………………. 92
4.2. Về kết quả đánh giá hiệu quả liền vết thương in vitro sử dụng
ADMSC-EX và plasma lạnh…………………………………………………………….. 96
4.2.1. Về kết quả tối ưu phương pháp chiếu plasma lạnh trên nguyên
bào sợi ………………………………………………………………………………… 96
4.2.2. Về kết quả đánh giá hiệu quả liền vết thương in vitro sử dụng
ADMSC-EX và plasma lạnh trên nguyên bào sợi…………………….. 98
4.3. Về kiểm tra kết quả in vitro trên vết thương da động vật thực nghiệm… 105
4.3.1. Về kết quả xây dựng mô hình ĐTĐ/RLLP trên chuột cống trắng… 105
4.3.2. Về kết quả điều trị thử nghiệm điều trị CAP và ADMSC-EX trên
vết thương ở chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP………………………………… 109
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 129
KHUYẾN NGHỊ……………………………………………………………………………… 131
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCDANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các tiêu chí đánh giá tổn thương đại thể trên vết thương……….. 48
Bảng 3.1. Kết quả số lượng, chất lượng dịch mô mỡ sau ly tâm, tách chiết…. 53
Bảng 3.2. Kết quả MSC thu được ở giai đoạn nuôi cấy sơ cấp …………….. 54
Bảng 3.3. Tỷ lệ tế bào mang dấu ấn dương tính và tế bào mang dấu ấn âm
tính trong nghiên cứu …………………………………………………………. 58
Bảng 3.4. Kết quả thể tích exosome sau ly tâm …………………………………… 61
Bảng 3.5. Phân bố một số yếu tố tăng trưởng của các mẫu exosome……… 64
Bảng 3.6. Đánh giá khả năng kích thích tạo mạch từ ADMSC-EX ……….. 65
Bảng 3.7. Theo dõi tốc độ phát triển của nguyên bào sợi sau khi chiếu
plasma lạnh theo thời gian …………………………………………………. 67
Bảng 3.8. Kết quả tỷ lệ che phủ diện tích vết rạch của nguyên bào sợi
trên mô hình liền vết thương in vitro…………………………………… 71
Bảng 3.9. Độ hấp phụ quang của nguyên bào sợi………………………………… 72
Bảng 3.10. Thay đổi khối lượng chuột trong thí nghiệm………………………… 73
Bảng 3.11. Nồng độ các chỉ số lipid huyết thanh của chuột sau khi nuôi
dưỡng với chế độ ăn giàu chất béo trong 6 tuần……………………. 74
Bảng 3.12. Sự thay đổi nồng độ glucose lúc đói trong máu trước và sau
khi tiêm STZ ……………………………………………………………………. 75
Bảng 3.13. Theo dõi cân nặng của chuột trong quá trình thử nghiệm………. 77
Bảng 3.14. Theo dõi đường huyết lúc đói của chuột trong thí nghiệm …….. 78
Bảng 3.15. Kết quả CRP và công thức máu của chuột sau 3 ngày điều trị .. 79
Bảng 3.16. Tổng điểm đại thể đánh giá vết thương trong nghiên cứu………. 81
Bảng 3.17. Theo dõi tốc độ co vết thương trong nghiên cứu…………………… 83
Bảng 3.18. Phân bố tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trong dịch tại vết thương…………. 86
Bảng 3.19. Phân bố tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng tại vết thương trong nghiên cứu .. 88DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Kết quả xác định dấu ấn của MSC bằng bằng kỹ thuật đếm tế
bào dòng chảy ………………………………………………………………… 57
Biểu đồ 3.2. Kết quả phân bố kích thước ADMSC-EX bằng kỹ thuật theo
dõi chuyển động hạt nano NTA………………………………………… 63
Biểu đồ 3.3. Tốc độ tăng sinh của nguyên bào sợi sau khi chiếu plasma
lạnh theo thời gian theo dõi. …………………………………………….. 68
Biểu đồ 3.4. Đánh giá tốc độ co hồi vết thương trong nghiên cứu …………… 82
Biểu đồ 3.5. Phân bố tình trạng có vi khuẩn khi nuôi cấy theo nhóm điều
trị plasma lạnh………………………………………………………………… 87
Biểu đồ 3.6. Tình trạng nhiễm tụ cầu vàng tại vết thương theo nhóm điều
trị plasma lạnh………………………………………………………………… 88
Biểu đồ 3.7. Theo dõi thời gian liền vết thương trong nghiên cứu…………… 89DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn liền vết thương sinh lý ……………………………………. 5
Hình 1.2. Thành phần, dấu dấn bề mặt và sự giải phóng exosome ………… 15
Hình 1.3. Sơ đồ phân lập bằng siêu ly tâm vi sai ………………………………… 17
Hình 1.4. Hình ảnh exosome dưới kính hiển vi điển tử truyền qua TEM ….. 18
Hình 1.5. Sơ đồ minh họa một thiết bị plasma lạnh …………………………….. 20
Hình 1.6. Thành phần và tác dụng sinh học của plasma lạnh………………… 21
Hình 1.7. Giả thuyết cơ chế tác dụng diệt khuẩn của plasma lạnh…………. 25
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình trong nghiên cứu ……………………………………….. 32
Hình 2.2. Phương pháp điều trị CAP và ADMSC-EX trong nghiên cứu …. 46
Hình 2.3. Tiến trình điều trị trên mô hình vết thương trên động vật………. 50
Hình 3.1. Tế bào đơn nhân phân lập từ mô mỡ sau ly tâm lần đầu khi
vừa gieo vào chai nuôi cấy ………………………………………………… 55
Hình 3.2. Quần thể tế bào đơn nhân sau nuôi cấy ngày thứ 7……………….. 55
Hình 3.3. Tế bào đơn nhân phát triển trong quá trình cấy chuyền …………. 56
Hình 3.4. Khả năng biệt hóa tạo sụn của tế bào ………………………………….. 59
Hình 3.5. Khả năng biệt hóa tạo mỡ của tế bào gốc trung mô ………………. 59
Hình 3.6. Khả năng tạo xương của tế bào gốc trung mô mô mỡ……………. 59
Hình 3.7. Khả năng tạo cụm của tế bào gốc trung mô mô mỡ ………………. 60
Hình 3.8. Hình ảnh exosome dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (n=10) 62
Hình 3.9. Biểu hiện dấu ấn CD9, CD63, TSG101, HSP70, Tubulin ……… 64
Hình 3.10. Đánh giá khả năng kích thích tạo mạch của ADMSC-EX ……… 66
Hình 3.11. Theo dõi nguyên bào sợi phát triển sau khi chiếu plasma lạnh.. 69
Hình 3.12. Theo dõi sự di chuyển nguyên bào sợi trên mô hình liền vết
thương in vitro …………………………………………………………………. 70
Hình 3.13. Hình ảnh mô tụy của chuột ở 2 nhóm thí nghiệm …………………. 76
Hình 3.14. Vết thương ở các nhóm trong nghiên cứu theo thời gian……….. 80
Hình 3.15. Vi thể vết thương của các nhóm ngày thứ 7 sau điều trị ………… 84
Hình 3.16. Vi thể vết thương của các nhóm ngày thứ 14 sau điều trị ………. 8