Nghiên cứu tách dòng Gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở Người

Hemophilia A là bệnh máu khó đông do sự thiếu hụt (về lượng hoặc về chất) yếu tố đông máu

VIII. Gen mã  hoá  cho yếu  tố  này  nằm  tại  vùng q28, trên cánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X và khi đột biến sẽ gây ra bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X. Gen mã hóa yếu tố VIII là một  trong những  gen lớn  nhất  cơ thể,  có  kích thước 186 kb. Gồm 25 intron và vùng gen mã hóa dài 9 kb với 26 exon (Levinson, B et al., 1990).

Hemophilia có  thể  xuất  hiện  ở  thể  nhẹ,  trung bình hay nặng tương đương mức yếu tố VIII trong huyết tương lần lượt là 6 – 30%, 1 – 5% và dưới 1%. Thể Hemophilia nhẹ thường chỉ chảy máu sau chấn thương hoặc  sau phẫu  thuật,  còn  thể  nặng  có  thể chảy máu tự phát hoặc sau những sang chấn nhẹ, nhất là ở khớp và cơ, trung bình mỗi năm chảy máu 20 – 30 lần,  nhưng cũng có thể  nhiều  hơn. Tỷ  lệ bệnh là 1/10.000 trẻ mới sinh.

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc Hemophilia trong cộng  đồng  khá  cao 2/34830 người  (tương đương 25 – 60 người trên 1 triệu dân), nhu cầu yếu tố VIII dùng  trong điều  trị và  dự  phòng  rất  lớn.  Do đó, việc nghiên cứu sản xuất yếu tố VIII tái tổ hợp là việc làm hết sức cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao trong lâm sàng huyết học, giải quyết trực tiếp một vấn đề bức thiết đang đặt ra cho y học nước ta. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở người” nhằm mục tiêu:

1. Khuếch  đại  vùng  gen chức  năng  mã  hóa yếu tố VIII.

2. Tách và biến nạp các vùng gen chức năng của yếu tố VIII vào vector tách dòng.

Đây là bước để chuẩn bị nguyên liệu cho việc thiết kế vector biểu hiện yếu tố đông máu VIII tái tổ hợp trên cả hệ vi khuẩn E. Coli và tế bào động vật  phục  vụ  cho việc  tổng  hợp  yếu  tố  VIII tái  tổ hợp và liệu pháp điều trị gen.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng và nghiên cứu

Mô gan của người do bệnh viện K cung cấp. Chủng  Escherichia  coli  DH5  (bảo  quản  ở  – 700C) và vector tách dòng p.QE 30 – UA và các loại   hóa   chất   cần   thiết   khác   được   mua  từ QIAGEN, Hoa Kỳ.

2. Phương pháp nghiên cứu

– Tách  chiết  RNA tổng  số  từ  mô  gan  người bằng  dung dịch Trizol của  hãng  Invitrogen theo quy trình hướng dẫn của hãng.

– Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số bằng phương pháp MMLV – RT.

– Khuếch đại đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hóa yếu tố VIII từ cDNA sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu: A1A2  mang  trình  tự  cắt  của  enzym  PmlI  và EcoRV, A3C2 mang trình tự cắt của enzym SmaI và SalI.

Thành phần phản ứng PCR gồm: 1X đệm PCR; 2,5 mM dNTP; 10 pM mồi xuôi và ngược; 1µl Taq polymerase và 3000 ng cDNA.

Chu trình nhiệt  của  phản  ứng  PCR: 950C – 10 phút;  35 chu kỳ [950C – 50 giây, 550C – 50 giây, 720C – 2 phút]; 720C – 10 phút; bảo quản mẫu ở 100C.

– Tách dòng 2 đoạn gen A1A2 và A3C2: Sản phẩm  PCR sau khi được  tinh sạch  bằng  bộ  kit QIAquick PCR purification, sẽ được gắn vào vec- tor biểu  hiện  pQE 30 – UA bằng  enzym T4 – DNA ligase ở  điều  kiện  160C qua  đêm.  Sau đó, hỗn hợp sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt. Dòng   plasmid  tái   tổ   hợp   được   chọn   lọc   và chuyển  sang nuôi cấy trong môi trường LB lỏng. Sự  có  mặt  của  đoạn  gen A1A2 và  A3C2 được kiểm  tra bằng  phương pháp  PCR và  cắt  enzym giới hạn.

Hemophilia A là bệnh chảy máu di truyền do sự thiếu hụt yếu tố đông máu VIII. Mục tiêu: (1) Khuếch đại vùng gen chức năng mã hóa yếu tố VIII; (2) Tách và biến nạp các vùng gen chức năng của yếu tố VIII vào vector tách dòng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: đoạn gen A1A2 và A3C2 được khuếch đại bằng PCR từ cDNA gan người sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được đưa vào vector tách dòng pQE – 30UA. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng E.coli DH5. Kiểm tra sự có mặt của 2 đoạn gen trong vector tách dòng bằng phương pháp PCR và cắt enzym giới hạn. Kết quả: đã khuếch đại và đưa thành công 2 đoạn gen mã hóa yếu tố VIII vào vector tách dòng. Kết luận: 1) Đã khuếch đại thành công vùng gen chức năng mã hóa yếu tố VIII A1A2 và A3C2; 2) Đã tách và biến nạp thành công các vùng gen chức năng của yếu tố VIII vào vector tách dòng .